Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,,,‹#›,研究背景,,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkin’s lymphoma,，,HL,，,Hodgkin’s disease,，）是,恶性淋巴瘤,的一个独特类型研究背景,其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散原发于结外淋巴组织的少见研究背景,②,瘤组织成分多样，但,HL,特异性的病理改变为,——,大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于,1%Reed-Sternberg,细胞（,R-S,细胞）这种特殊的瘤巨细胞来源于,B,淋巴细胞,(,镜影细胞,),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突变,,,,,EB,病毒感染,但证据均不足，,HL,的发病机制,尚未明确,肿瘤细胞,,,,研究背景,有研究发现,NF-κB (RelA/P50),的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点[1],IκBα,作为重要的,NF-κB,通路,抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。
研究背景,将对,IκBα,激酶 （,IκBα kinase, IKK,）无反应的,IκBα,突变体导入,HRS,细胞中可阻断,NF-κB,的活化，导致细胞凋亡，说明,IκBα,在,HL,发病机制中有重要作用[2],,,研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,细胞中,IκBα mRNA,高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与,HL,中泛素化降解活性增强有关，也可能由,IκBα,蛋白结构改变导致[3],,研究目的,本实验意在：,①了解,IκBα,基因在,HL,中突变的情况；,②分析经典型,HL HRS,中,IκBα,突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,③以及这些异常的病理意义，即其与,HL,发病的相关性实验材料与试剂,霍奇金淋巴瘤组织样本,CD30,单抗,（,Dako,公司，克隆号,Ber,—,H2,，效价,1,：,20,）,Leica ASLMD,激光显微,系统,PCR,引物,（,北京赛百胜公司,）,PCR,仪（包括反应体系）,DNA,测序仪,,实验流程,CD30,免疫组化,,激光显微切割和,DNA,提取,,IκBα,基因扩增,,PCR,产物检测,,待测基因外含子,测序,,,CD30,免疫组化,,采用,EnVision,两步法,。
将冰冻组织切成,6,μ,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,．,05,％,NP40,的丙酮,(v,／,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,,CD30,免疫组化,6,％,H2O2-,甲醇，,37,℃,10 min,，消除内源性过氧化物酶；,,加,1,：,20,稀释的一抗；,,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗激光显微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系统逐个切割组织切片上的,CD30,阳性细胞,（,切割参数：激光强度,37,，波长,377,，速度,5,，光束直径,8,）,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本,3,～,6,组，每组约,25,～,70,个细胞切割周围的正常淋巴细胞每例,2,管，,每管约,50,个细胞扩增目的基因，上游引物：,5,’,-CACACTGTGCCCATCTACG-3,’，下游引物：,5,’一,GGTc1-ITI,’,GCGGATGTCCAC,一,3,’,缓冲体系：,10X,反应缓冲液,2,．,5,μ,l,，,MgCL,2,(25 mmol,／,L)1,．,5,μ,l,，,dNTP(10 mmoL,／,L)1,．,0,μ,l,，上游引物,(10~,μ,moL,／,L)0,．,5,μ,l,，下游引物,(10,μ,mol,／,L)0,．,5,μ,l,，,Taq,酶,(5 U,／ μ,L)0,．,3,μ,l,，,,模板,2,．,0,μ,l,，总体积,25,μ,l,。
反应条件：,94,℃预变性,5 min,，,94,℃变性,1 min,，,55,％退火,1 min,，,72oC,延伸,1 min,，共,40,个循环，,72,℃延伸,7min,，至,4,℃结束以双蒸水代替,DNA,模板作为阴性对照IκBα,基因扩增,对,HRS,细胞、背景中反应性增生细胞的,IκBα,6,个外显子进行半巢式,PCR,扩增用已知,IκBα,外显子,PCR,扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本3～6组，每组约25～70个细胞6％ H2O2-甲醇，37℃ 10 min，消除内源性过氧化物酶；,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。
如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,PCR仪（包括反应体系）,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR激光显微切割和DNA 提取,PCR,扩增反应体系,扩增,IκBα,第一和第二外显子反应体系：,10 X PCR,缓冲液,5,．,0,μ,1,，,MgC1,：,(25mmoi,／,L)5,．,0,μ,Ixl,，,dNTPs(10 mmol,／ μ,L)2,．,0,μ,l,，,DMSO2,．,0,μ,l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,／,pJ)1,．,0,μ,l,，,DNA,模板,(0,．,5 g,／,IL1)2,．,0,μ,l,，扩增第一外显子时加引物,1,μ,Ixl,；扩增第二外显子时加引物,0,．,3,μ,l,，补所需,ddH2O,使反应体系达到,50,μ,I,。
反应条件：预变性,95,℃ ，,5min,，继而,95,℃变性,50 s,，,65,℃退火,30 s,，,72,℃延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,℃延伸,10 min,第二轮，反应体系,50,μ,l,，扩增第一和第二外显子时加引物,1,．,25,μ,l,扩增第一外显子时另加,2,μ,l DMSO(,扩增第二外显子时不加,DMSO),反应条件同第一轮扩增,IκBα,第三到第六外显子反应体系,：,,第一轮，,l0,×,PCR,缓冲液,5,．,0,μ,Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,／,L)4,．,0 l,，,dNTPs(10 mmol,／,L)2,．,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,／ μ,L)1,．,0,μ,l,，,DNA,模板,(0,．,5,μ,g,／,,μ,L)2,．,0,μ,l,，引物,1,μ,l,反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为,63,℃第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为,1,．,25,μ,L,反应条件为预变性,95,℃ ，,5 min,，继而,95,℃变性,50 S,，,65,℃退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,℃延伸,10 min,。
PCR,产物检测,取,5,μ,l PCR,产物，用,2,％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流,120 mA,，,20 min,紫外灯下观察IκBα,的,6,个外显子阳性扩增产物大小分别为,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon5(381bp),和,exon6(441bp),预期结果,——,电泳,电泳条带不在同一水平线上,——,基因明显突变预期结果,——,电泳,电泳条带在同一水平线上没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,,待测基因外含子,测序,,每管,DNA,样品都要扩增,2,次，使用上海博亚公司,ABI377DNA,测序仪对,PCR,阳性产物进行直接测序预期结果,——,测序,碱基序列出现改变,图,A-,箭头处为,T-A,突变（,TGA,为终止密码）,图,B-,反向测序证实,（蓝色,-C,,红色,-T,，绿色,-A,，黑色,-G,）,预期结果,碱基序列没有突变,C,、,D,分别为没有突变的正、反向测序,预期结果,肿瘤细胞,I,κ,B,α,基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞,I,κ,B,α,基因没有突变。
肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,κ,B,α,基因都没有突变肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,κ,B,α,的突变率都增加,,IκBα,基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关,,IκBα,基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,,,,,,,,估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究,,参考文献,[1] Bargou R.C,,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,J Clin Invest,, 1997, 100 (12): 2961-9.,[2] Dejardin E,,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Oncogene,, 1999, 18(16):2567-77.,[3] Emmerich F,,et al,. Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,Blood,, 1999, 94(9): 3129-34.,……,Thank you,！,,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,采用EnVision两步法。
激光显微切割和DNA 提取,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序电泳条带在同一水平线上EnVision两步法,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,C、D分别为没有突变的正、反向测序,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,[1] Bargou R.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l电泳条带在同一水平线上激光显微切割和DNA 提取,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),点突变或分子量很小的碱基序列突变,巢式,PCR,巢式聚合酶链反应,(nested polymearse chain reaction, nPCR),也称套式,PCR,。
在这种技术中，首先用一对外引物进行第,1,轮,PCR,，然后再使用第,1,对引物扩增的,DNA,序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式,PCR,为了经济节约，可在第,2,轮扩增时采用,半巢式，,设计单条引物，另一条引物与第,1,轮扩增共用，反向测序,一个是,正向引物（上游引物），,用它来测序就是正向测序,(,从上游往下测序,),，也就是,5',到,3',另外一个就是,反向引物（下游引物,），用它来测序就是反向测序（从下游往上测序），也就是,3',到,5',如果片段在,800,以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了,如果在,800-1600,之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证,800bp,以内是可信的）,,EnVision,两步法,,DAKO EnVision,显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即,EnVision,）直接放大信号,40-50,倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）CD30,免疫组化,,采用,EnVision,两步法,将冰冻组织切成,6,μ,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,．,05,％,NP40,的丙酮,(v,／,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,,CD30,免疫组化,6,％,H2O2-,甲醇，,37,℃,10 min,，消除内源性过氧化物酶；,,加,1,：,20,稀释的一抗；,,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。
预期结果,——,电泳,电泳条带在同一水平线上没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,,参考文献,[1] Bargou R.C,,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,J Clin Invest,, 1997, 100 (12): 2961-9.,[2] Dejardin E,,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Oncogene,, 1999, 18(16):2567-77.,[3] Emmerich F,,et al,. Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,Blood,, 1999, 94(9): 3129-34.,……,Thank you,！,,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,PCR仪（包括反应体系）,[1] Bargou R.,扩增第一外显子时另加2 μ l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。
点突变或分子量很小的碱基序列突变,[3] Emmerich F, et al.,扩增IκBα第一和第二外显子反应体系：,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,PCR仪（包括反应体系）,（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,IκBα的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、 exon2(433bp)、 exon3(399bp)、 exon4(184bp)、 exon5(381bp)和 exon6(441bp)。
取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min反应条件为预变性95℃ ，5 min，继而95℃变性50 S，65℃退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 minC、D分别为没有突变的正、反向测序,C、D分别为没有突变的正、反向测序,点突变或分子量很小的碱基序列突变,②分析经典型HL HRS中IκBα突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即 EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。
PCR仪（包括反应体系）,取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 minOverexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5'到3',点突变或分子量很小的碱基序列突变,第一轮，l0×PCR缓冲液5．0 μ Ixl，MgCL2(25 mmol／L)4．0 l，dNTPs(10 mmol／L)2．0 l，Taq DNA聚合酶(5 U／ μL)1．0 μ l，DNA模板(0．5 μ g／ μL)2．0 μ l，引物1 μ l有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点采用EnVision两步法EnVision两步法,EnVision两步法,CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20）,反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min。
第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25 μ LPCR仪（包括反应体系）,反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min加1：20稀释的一抗；,采用EnVision两步法切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变[3] Emmerich F, et al.,（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l。
EnVision两步法,采用EnVision两步法Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Leica ASLMD激光显微系统,将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含0．05％ NP40的丙酮(v／v)固定10 min，室温下自然干燥；,Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBα mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束。
肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,点突变或分子量很小的碱基序列突变,电泳条带不在同一水平线上——基因明显突变Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,Leica ASLMD激光显微系统,Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l。
肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加,EnVision两步法,点突变或分子量很小的碱基序列突变,[1] Bargou R.,第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25 μ LEnVision,两步法,,DAKO EnVision,显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即,EnVision,）直接放大信号,40-50,倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。