Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,研究背景,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkins lymphoma,，,HL,，,Hodgkins disease,，）是,恶性淋巴瘤,的一个独特类型研究背景,其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散原发于结外淋巴组织的少见研究背景,瘤组织成分多样，但,HL,特异性的病理改变为,大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于,1%Reed-Sternberg,细胞（,R-S,细胞）这种特殊的瘤巨细胞来源于,B,淋巴细胞,(,镜影细胞,),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突变,EB,病毒感染,但证据均不足，,HL,的发病机制,尚未明确,肿瘤细胞,研究背景,有研究发现,NF-B(RelA/P50),的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点1,IB,作为重要的,NF-B,通路,抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少研究背景,将对,IB,激酶（,IB kinase,IKK,）无反应的,IB,突变体导入,HRS,细胞中可阻断,NF-B,的活化，导致细胞凋亡，说明,IB,在,HL,发病机制中有重要作用。
2,研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,细胞中,IB mRNA,高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与,HL,中泛素化降解活性增强有关，也可能由,IB,蛋白结构改变导致3,用已知IB外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照但证据均不足，HL的发病机制,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,扩增第二外显子时加引物03 l，补所需ddH2O使反应体系达到50 I巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,nPCR)也称套式PCR为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）,EnVision两步法,电泳条带在同一水平线上Thank you！,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞),CD30单抗（Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20）,加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。
2 Dejardin E,et al.,如果片段在800以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了,DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育霍奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型扩增IB第三到第六外显子反应体系：,Blood,1999,94(9):3129-34.,PCR引物（北京赛百胜公司）,研究目的,本实验意在：,了解,IB,基因在,HL,中突变的情况；,分析经典型,HL HRS,中,IB,突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,以及这些异常的病理意义，即其与,HL,发病的相关性实验材料与试剂,霍奇金淋巴瘤组织样本,CD30,单抗,（,Dako,公司，克隆号,Ber,H2,，效价,1,：,20,）,Leica ASLMD,激光显微,系统,PCR,引物,（,北京赛百胜公司,）,PCR,仪（包括反应体系）,DNA,测序仪,实验流程,CD30,免疫组化,激光显微切割和,DNA,提取,IB,基因扩增,PCR,产物检测,待测基因外含子,测序,CD30,免疫组化,采用,EnVision,两步法,。
将冰冻组织切成,6,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,05,NP40,的丙酮,(v,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,CD30,免疫组化,6,H2O2-,甲醇，,37,10 min,，消除内源性过氧化物酶；,加,1,：,20,稀释的一抗；,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗激光显微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系统逐个切割组织切片上的,CD30,阳性细胞,（,切割参数：激光强度,37,，波长,377,，速度,5,，光束直径,8,）,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本,3,6,组，每组约,25,70,个细胞切割周围的正常淋巴细胞每例,2,管，,每管约,50,个细胞扩增目的基因，上游引物：,5,-CACACTGTGCCCATCTACG-3,，下游引物：,5,一,GGTc1-ITI,GCGGATGTCCAC,一,3,缓冲体系：,10X,反应缓冲液,2,5,l,，,MgCL,2,(25 mmol,L)1,5,l,，,dNTP(10 mmoL,L)1,0,l,，上游引物,(10,moL,L)0,5,l,，下游引物,(10,mol,L)0,5,l,，,Taq,酶,(5 U,L)0,3,l,，,模板,2,0,l,，总体积,25,l,。
反应条件：,94,预变性,5 min,，,94,变性,1 min,，,55,退火,1 min,，,72oC,延伸,1 min,，共,40,个循环，,72,延伸,7min,，至,4,结束以双蒸水代替,DNA,模板作为阴性对照IB,基因扩增,对,HRS,细胞、背景中反应性增生细胞的,IB,6,个外显子进行半巢式,PCR,扩增用已知,IB,外显子,PCR,扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照PCR,扩增反应体系,扩增,IB,第一和第二外显子反应体系：,10 X PCR,缓冲液,5,0,1,，,MgC1,：,(25mmoi,L)5,0,Ixl,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0,l,，,DMSO2,0,l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,pJ)1,0,l,，,DNA,模板,(0,5 g,IL1)2,0,l,，扩增第一外显子时加引物,1,Ixl,；扩增第二外显子时加引物,0,3,l,，补所需,ddH2O,使反应体系达到,50,I,反应条件：预变性,95,，,5min,，继而,95,变性,50 s,，,65,退火,30 s,，,72,延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,延伸,10 min,。
第二轮，反应体系,50,l,，扩增第一和第二外显子时加引物,1,25,l,扩增第一外显子时另加,2,l DMSO(,扩增第二外显子时不加,DMSO),反应条件同第一轮扩增,IB,第三到第六外显子反应体系,：,第一轮，,l0,PCR,缓冲液,5,0,Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,L)4,0 l,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,L)1,0,l,，,DNA,模板,(0,5,g,L)2,0,l,，引物,1,l,反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为,63,第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为,1,25,L,反应条件为预变性,95,，,5 min,，继而,95,变性,50 S,，,65,退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,延伸,10 min,PCR,产物检测,取,5,l PCR,产物，用,2,琼脂糖凝胶电泳分析，稳流,120 mA,，,20 min,紫外灯下观察IB,的,6,个外显子阳性扩增产物大小分别为,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon5(381bp),和,exon6(441bp),。
预期结果,电泳,电泳条带不在同一水平线上,基因明显突变预期结果,电泳,电泳条带在同一水平线上没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,待测基因外含子,测序,每管,DNA,样品都要扩增,2,次，使用上海博亚公司,ABI377DNA,测序仪对,PCR,阳性产物进行直接测序扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 LIB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,nPCR)也称套式PCR6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；,Leica ASLMD激光显微系统,电泳条带在同一水平线上。
第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L点突变或分子量很小的碱基序列突变,2 Dejardin E,et al.,EnVision两步法,Thank you！,扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序Blood,1999,94(9):3129-34.,C、D分别为没有突变的正、反向测序,Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IB蛋白结构改变导致电泳条带不在同一水平线上基因明显突变一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3,预期结果,测序,碱基序列出现改变,图,A-,箭头处为,T-A,突变（,TGA,为终止密码）,图,B-,反向测序证实,（蓝色,-C,红色,-T,，绿色,-A,，黑色,-G,）,预期结果,碱基序列没有突变,C,、,D,分别为没有突变的正、反向测序,预期结果,肿瘤细胞,I,B,基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞,I,B,基因没有突变。
肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,B,基因都没有突变肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,B,的突变率都增加,IB,基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关,IB,基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究,参考文献,1 Bargou R.C,et al,.Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.,2 Dejardin E,et al,.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,Oncogene,1999,18(16):2567-77.,3 Emmerich F,et al,.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB a。