单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,皮肤科细胞培养及临床应用,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,皮肤科细胞培养及临床应用,*,皮肤病学相关研究中 所涉及的细胞培养问题,中国医学科学院皮肤病研究所,,李新宇,,2004,年,2,月,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,1,皮肤病学相关研究中 所涉及的细胞培养问题中国医学科学院皮肤病,细胞培养涉及的基本知识,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,2,细胞培养涉及的基本知识皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/,最常见的两种生长型细胞,贴壁依赖性细胞,(Anchorage-dependent cells),,贴附于不起化学作用的物质,(,玻璃、或塑料等无活性物质,),的表面生长、生存和维持悬浮培养细胞,(Suspension culture),,细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,3,最常见的两种生长型细胞贴壁依赖性细胞(Anchorage-d,细胞培养中常用的几个术语,细胞系,(Cell line),：,,原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。
连续传代 连续传代,,,连续细胞系 有限细胞系,,(,已建成的细胞系,),,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,4,细胞培养中常用的几个术语细胞系(Cell line)：皮肤科,细胞株,(Cell strain):,,由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系细胞周期,(Cell cycle),,细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程4,个时期：,S,期：,DNA,合成期,,M,期：有丝分裂期,,G1,期：有丝分裂完成至,DNA,合成开始的间隙期,,G2,期：,DNA,复制结束至有丝分裂开始的间隙期,,,G0,期：某种原因导致细胞不再沿周期进行，进入,休眠状态,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,5,细胞株(Cell strain):皮肤科细胞培养及临床应用2,细胞一代时间,(Cell generation time),,单个细胞两次连续分裂的时间间隔群体倍增时间,(Population doubling time),,在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所,需要的时间皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,6,细胞一代时间(Cell generation time)皮肤,克隆,(Clone),,单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。
细胞融合,(Cell fusion),,体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞,(Hybrid),细胞汇合,(Confluence),,器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,7,克隆(Clone)皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/37,原代培养,(Primary culture),,从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的,培养传代培养,(Passage)(Subculture),,细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿,中培养再培养,(Reculture),,单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基,中的过程皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,8,原代培养(Primary culture)皮肤科细胞培养及临,集落形成率,(Plating efficiency),,细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率单个细胞 集落 克隆形成率,(Cloningefficiency),,群体密度,(Population density),,培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数,(,细,胞数,/cm,2,),。
饱和密度,(Saturation density),,特定条件下，培养器皿中能达到的最高细胞数,,(,细胞数,/cm2,或细胞数,/cm3),皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,9,集落形成率(Plating efficiency)皮肤科细胞,培养基,培养基,天然培养基,合成培养基,基本培养基,(,通用培养基,)(MEM ),,无血清培养基,无蛋白培养基,血清,基本培养基,(,通用培养基,),完全培养基,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,10,培养基培养基皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/310,基本培养基的组分,,四大类物质 无机盐,氨基酸,维生素,碳水化合物,,pH,指示剂 酚红,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,11,基本培养基的组分皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/311,常用基本培养基,,,RPMI 1640,应用最广泛,,,DMEM,高糖型,4500g/L,葡萄糖，,低糖型,1000g/L,葡萄糖,,,HamF12,无血清培养基常用的基础培养,基,,,199,……,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,12,常用基本培养基皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/312,培养基的选择,,,培养细胞的首选培养基,常用培养基,根据细胞株特点、实验需要选择,用生长曲线、集落形成率等指标选择,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,13,培养基的选择皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/313,培养基配制时的注意事项,,严格按说明书要求添加必要成分,,NaHCO,3,,谷氨酰胺,,HEPES,------,,各成分顺序溶解,配制培养基用水、器皿,灭菌,分装、保存,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,14,培养基配制时的注意事项皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/,培养基添加成分,,NaHCO3,,一般按说明书要求添加,封闭式培养用,5.6%,或,7.4%,液调节,谷氨酰胺,易降解，使用前添加,使用终浓度,0.002mol/L,HEPES(,羟乙基哌嗪乙硫磺酸,),,主要作用为防止培养基,pH,迅速变动,使用终浓度,0.01- 0.015mol/L,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,15,培养基添加成分皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/315,完全培养基的添加成分,牛血清,,,小牛血清：取自出生,10,～,30,天的小牛。
新生牛血清：取自出生,24,小时之内的新生牛胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方,法获得皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,16,完全培养基的添加成分牛血清 皮肤科,血清的主要作用,,提供细胞生长所需的基本营养物质激素、生长因子、结合蛋白,),,提供贴壁和扩展因子,(,纤连蛋白,,,层粘连蛋白,),对培养中的细胞提供保护作用抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作用,终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作用,血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所受的机,械损伤,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,17,血清的主要作用皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/317,使用血清的缺点,,改变细胞在体内的正常状态,促进某些细胞生长同时抑制另一类细胞生长所含物质对细胞生长的影响或毒性作用,批间成分的一致性,支原体、病毒的潜在污染性,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,18,使用血清的缺点皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/318,血清质量的判断,,质量鉴定报告,理化性质,微生物检测,,促生长效果,(,培养细胞检测,),,,克隆形成率、贴壁率测定,连续传代培养,,外观判断,,透明清亮,土黄色或棕黄色,无沉淀或及少量沉淀,较粘稠,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,19,血清质量的判断皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/319,血清的使用与贮存,,灭活处理,: 56℃,水浴,, 30,分钟,(,去除补体,),,贮存条件,:,分装,,-20 ℃,长期贮存,,,避免反复冻融,,4 ℃, < 1,个月,融化步骤,: -20 ℃ 4 ℃,室温,使用浓度,: 5%,～,20%,,常用,10%,,临用前添加于培养基中,,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,20,血清的使用与贮存皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/320,无血清培养基,用途,,观察生长因子对细胞的作用,,,需排除其它生长因子的干扰作用,,测定细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力,,大规模培养细胞，获得分泌产物,,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,21,无血清培养基用途皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/321,无血清培养基的组成,,基础培养基,,,HamF12 : DMEM = 1 : 1,,添加组分,,促贴壁物质（细胞外基质，如纤连蛋白,,,层粘连,蛋白）,促生长因子及激素,酶抑制剂（终止胰酶消化作用，保护细胞，如大,豆胰酶抑制剂）,,… …,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,22,无血清培养基的组成皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/32,更换无血清培养基的注意事项,,针对性强,直接适应,连续适应,逐步降低血清浓度,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,23,更换无血清培养基的注意事项皮肤科细胞培养及临床应用2023/,无蛋白培养基,(PFM),,不含动物蛋白的培养基，以添加植物水解物,替代动物激素、生长因子。
用途,,生物技术产品生产,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,24,无蛋白培养基(PFM) 皮肤科细胞培养及临床应用20,,限定化学成分培养基,(CDM),,培养基中所有成分明确，不含动物蛋白，也,不添加植物水解物，而使用一些已知结构与功能,的小分子化合物,(,短肽、植物激素等,),用途,,分析细胞分泌产物,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,25,限定化学成分培养基(CDM)皮肤科细胞培养及临床应用20,,细胞培养中的其它用液,,平衡盐溶液,,,PBS,Hank’s,液,,D-Hank’s,液,,------,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,26,细胞培养中的其它用液皮肤科细胞培,消化液,,胰酶溶液,(0.1,～,0.25%),D-Hank’s,液配制,最佳,pH,值：,8,～,9,,EDTA,溶液,(0.02%),,用于解离细胞,(,破坏细胞间的连接,),,与胰酶混合用于消化贴壁牢的细胞,,,胶原酶溶液,(0.1,～,0.3mg/L),,不易损伤细胞，不受,Ca,2+,,、,Mg,2+,及血清抑制,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,27,消化液皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/327,细胞培养的生长测定,血细胞计数法,,,细胞密度,(,个,/ml)=,平均细胞数,×10,4,×,稀释倍数,,,影响方法精确性的因素,,,贴壁细胞消化的时间,细胞悬液的均匀性,细胞浓度合适,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,28,细胞培养的生长测定血细胞计数法皮肤科细胞培养及临床应用202,台盼蓝染色法,,,正常细胞不染色，死亡细胞呈蓝色。
细胞活力,(%)=(,总细胞数,-,着色细胞数,) ÷,总细,胞数,×100%,,注意,为一种粗略的检测存活细胞的方法，,不能准确放映细胞活力差异判断时间,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,29,台盼蓝染色法皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/329,MTT,比色法,,活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮,唑盐,(MTT),，还原成紫色不溶性结晶物，沉积,于细胞中用酸性异丙醇或,DMSO,溶解后，于,酶标仪上测定光吸收值紫色不溶性结晶物形,成的多少与活细胞数目和功能状态相关细胞存活率,=,试验组光吸收值,÷,对照组光吸收值,×100%,,,MTT,法特点,高浓度血清的影响,简便迅速不接触同位素，敏感性与同位素法接近皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,30,MTT比色法皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/330,细胞生长曲线法,,可观察同一代细胞的增殖过程根据生长曲,线分析细胞增殖速度，确定具体实验,﹑,细胞传,代的最佳时间方法,总培养时间,7,天,计数每,24,小时细胞数目,绘制细胞生长曲线,,潜伏期,原代细胞,24-96h,,传代细胞,6-24h,,对数生长期,,3-5d,,倍增时间,,停滞期,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,31,细胞生长曲线法皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/331,3,H-TdR,掺入法,,3,H,标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新合,成的,DNA,中，通过测定,3,H,放射性脉冲数，计,算细胞的增殖活性。
特点,被标记的细胞为,S,期细胞，,3,H-TdR,掺入量放,映,DNA,合成的快慢放射性损害需要特殊实验室和特殊设备皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,32,3H-TdR掺入法皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/33,细胞培养中的传代换液问题,原代培养后的第一次传代,原代培养方法,细胞活性,细胞类型和特点,接种密度,培养条件,常规传代,传代时间 对数生长期,传代比例 原瓶细胞分于,2-4,瓶,贴壁细胞酶充分消化,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,33,细胞培养中的传代换液问题原代培养后的第一次传代皮肤科细胞培养,二,.,角质形成细胞培养问题,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,34,二. 角质形成细胞培养问题皮肤科细胞培养及临床应用2023/,,角质形成细胞培养方法,,组织块培养法,,3T3,细胞为滋养层培养法,胶原为滋养层培养法,气,—,液交界面培养法,无血清培养法,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,35,角质形成细胞培养方法皮肤科细胞培养及临床应,组织块培养法,,,将表皮块贴附在培养瓶壁上,,,角质形成细胞逐渐从组织块边缘爬行长出。
特点,,稳定可靠,获得的细胞数量有限,细胞生长周期长,成纤维细胞污染,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,36,组织块培养法 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/336,3T3,细胞滋养层培养法,,3T3,细胞经丝裂霉素,C,或,γ-,射线预处理,(,失去分,裂增殖功能,),后,,,低密度接种在培养瓶壁上,,,再将角,质形成细胞种植在此细胞滋养层上3T3,细胞,,小鼠胚胎瘤成纤维细胞株,滋养层作用,促使角质形成细胞的贴附和生长,,,并形成集落,,,最后融合成复层鳞状上皮,接触性抑制成纤维细胞生长,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,37,3T3细胞滋养层培养法皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/,3T3,细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径,:,,,产生基质成分,,,促进角质形成细胞贴壁分泌促进角质形成细胞有丝分裂的活性因子通过细胞间相互作用,,,调节与角质形成细胞增殖相关的生 物因子皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,38,3T3细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径:皮肤科细胞培养及,3T3,细胞滋养层培养法特点,,细胞接种密度低、增殖速度快且细胞生长稳定。
3T3,细胞逐渐被挤压,,,随着角质形成细胞集落不断扩大形成,冠状,,,然后被压缩成条索状,,,最后脱落且消失3T3,细胞培养过程中会分泌异种蛋白和抗原,,,用它作为滋养,层培养的人角质形成细胞或人工表皮,,,移植后可能引起异种排,斥反应培养过程中角质形成细胞角化明显改进法,：向培养基中加入表皮生长因子、能增加细胞内,,cAMP,水平的试剂（霍乱毒素等）皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,39,3T3细胞滋养层培养法特点皮肤科细胞培养及临床应用2023/,胶原滋养层培养法,,,,角质形成细胞的贴壁率,玻璃培养瓶,2.8%,～,7%,,,塑料培养瓶,14%,,预铺胶原的塑料培养瓶,70%,～,80%,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,40,胶原滋养层培养法 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/3,胶原促进角质形成细胞粘附、生长的机制,,细胞外基质的主要成分,,,促进细胞贴壁覆盖培养瓶壁上不利于角质形成细胞粘附、,生长的化学基团为角质形成细胞提供粘附所需的特异性化学,基团为角质形成细胞的生长提供必要营养皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,41,胶原促进角质形成细胞粘附、生长的机制皮肤科细胞培养及临床应用,气,—,液界面培养法,,,,使表皮细胞在更接近正常人体的生理状态,下生长和分化。
培养皿内加上一层铺垫,,,再将皮肤角质形成,细胞接种其上,,,加入的培养液不超过铺垫水平,,,细胞通过铺垫吸收营养维持其生长发育接,种在铺垫上的细胞先进行浸泡性培养，一定时,间后铺垫支架升到气,-,液界面继续培养，使角,质形成细胞完成终末分化),,,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,42,气—液界面培养法 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/3,,铺垫,动物或人的尸体的皮肤真皮,玻璃纤维片,胶原膜或尼龙网,胶原膜和尼龙网的贴合物Transwell,培养皿,,特点,,能培养出多层类似正常皮肤的细胞层次，与正常皮肤非常接近,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,43,铺垫 动物或人的尸体的皮肤真皮皮肤科细胞培,无血清培养法,,,,含血清的传统培养方法特点,,必须在培养液中加入一定比例的血清以利于,细胞生长,,,但所含因素变化大,,,不明因素多,,,成份,复杂影响角质形成细胞生理和病理生理等的精细,研究,(,对表皮细胞的生长调节机制,,,培养表皮细胞因子的释放,,,特殊抗原和受体的表达研究等,),皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,44,无血清培养法 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/344,,无血清培养法特点,,技术要求较高。
培养基中需添加牛脑垂体提取物,(WBPE),或猪脑垂体提取物,(PWPE),排除了复杂的血清成分对人角质形成细胞的,不利因素影响为角质形成细胞培养的发展趋势皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,45,无血清培养法特点皮肤科细胞培养及临床应用2023/9,MCDB153,无血清培养基,角质形成细胞培养基适用于低密度接种的传代表皮细胞的生长,,,但,原代培养时细胞克隆形成率较低,,,不能满足较高,密度细胞生长的需要细胞以单层方式向外生长,,,但细胞之间缺乏桥粒,连接,,,不能形成表皮皮片培养液中的牛脑垂体提取物或猪脑垂体提取物,价格昂贵，疯牛病的危险皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,46,MCDB153无血清培养基皮肤科细胞培养及临床应用2023/,角质形成细胞无血清培养基,(DKSFM,Gibco,,),,去除牛脑垂体提取物保留对角质形成细胞的促生长作用,,,同时抑制成,纤维细胞生长角质形成细胞贴壁快,,,增殖迅速,,,细胞长满单层后,,,呈现出典型的铺路石状,,,细胞呈多角形细胞免疫组化染色抗角蛋白抗体染色阳性整个培养周期中,,,角质细胞呈现出基底细胞形状,,,细胞表面没有分泌物。
操作简便易行,,,安全适用,,,避免了以胶原或,3T3,细,胞为滋养层法的缺点皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,47,角质形成细胞无血清培养基(DKSFM,Gibco )皮肤科细,影响角质形成细胞培养的因素,,皮肤标本的来源,,正常人外科包皮环切手术弃之皮肤,标本运输和保存,,无菌容器,,短时间存放于平衡盐溶液,,,长时间存放于营,养液中标本预处理,,清洗、去除组织、剪切,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,48,影响角质形成细胞培养的因素皮肤科细胞培养及临床应用2023/,表皮和真皮的分离,,,胰蛋白酶,,分离基底细胞和上面的细胞既破坏桥粒又破坏半桥粒结构消化时间过长,,,丢失部分基底细胞消化时间过短,,,表皮和真皮分离不完全,,,混有,成纤维细胞皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,49,表皮和真皮的分离 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/34,中性蛋白酶,,,主要分解,IV,型胶原和纤维粘连蛋白作用于表皮和真皮的结合处只破坏半桥粒结构获得的角质形成细胞活力较高,,,增殖迅速,,,融,合成片的速度快减少成纤维细胞污染可获得含有完整基底层细胞的表皮。
Dispase(GIBCO),,,中性蛋白酶分离表皮和真皮,,,再用胰蛋白酶消化表皮成,为单个的细胞皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,50,中性蛋白酶 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/350,培养液中主要的添加物,,胰岛素,氢化可的松,三碘甲状腺原氨酸,霍乱毒素,转铁蛋白,表皮生长因子,,… …,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,51,培养液中主要的添加物皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/3,主要添加物的作用,促进细胞的葡萄糖和氨基酸的吸收促进细胞的粘附和增殖促进细胞的合成代谢提高细胞内第二信使,cAMP,水平降低铁离子对细胞的毒性促进角质形成细胞的有丝分裂皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,52,主要添加物的作用皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/352,钙离子浓度,,与表皮细胞体外培养的多层化有关,,,钙离子,浓度低至一定浓度时,,,细胞的分层现象消失低钙,(0.05,～,0.15mM),时角质形成细胞不分化,,,,细胞增殖最佳,;,当钙离子浓度上升到,1.0mM,时,,,,角质形成细胞发生分化,,,显示生长皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,53,钙离子浓度皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/353,角质形成细胞株,(,系,),应用,,,COLO-16,株,,来自于鳞状上皮癌的人角质形成细胞。
HaCaT,株,,永生化的正常人皮肤角质形成细胞,(>140,,代,),皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,54,角质形成细胞株(系)应用皮肤科细胞培养及临床应用2023/9,三,.,细胞培养技术在皮肤病相关领域中的应用,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,55,三. 细胞培养技术在皮肤病相关领域中的应用 皮肤科细胞培养及,,微载体培养,细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,,,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态特点,不增加培养容器表面积或培养基容积的前提下,提高培养表面积省却了容器等的清洗和准备工作细胞与培养液的分离简单减少繁复的操作步骤,,,降低污染率提高产率微载体制作材料的进展,,葡聚糖,纤维素,,聚乙烯和二氧化硅,,,聚苯乙烯,明胶,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,56,微载体,在化妆品功效研究中的应用,,传统皮肤细胞培养方法的应用,,单层ＫＣ的培养技术,---,皮肤组织获取和化妆品研发,,培养黑素细胞,---,美白化妆品活性成分筛选,朗格罕细胞、ＫＣ和Ｔ淋巴细胞共同培养,,---,体外筛选化妆品过敏作用,,富含,Merkel,细胞的表皮细胞悬液培养,,---,局部应用药物的耐受机制研究,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,57,在化妆品功效研究中的应用 传统皮肤细胞培养方法的应用皮肤科细,成纤维细胞的培养,,---,抗衰老化妆品活性成分开发中应用,(,筛选中,草药有效成分的抗衰老活性,),---,化妆品生理功效研究中应用,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,58,成纤维细胞的培养皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/358,皮肤细胞的“三维培养”,,器官型培养,(,气,-,液体交界面ＫＣ培养,),,,分离、培养皮肤的ＫＣ,,,使其在体外扩增,,,然后将其接种于真皮类似物上,,,暴露于空气中,,,使表皮正常分化,,,形成类似天然表皮的复层组织,(,体外重建表皮,),。
真皮类似物 去表皮真皮,胶原基质,惰性材料,,,应用,,,真皮类似物和重建表皮的组合形成具有表皮和真皮,的简化的人皮肤用成纤维细胞研究从表皮透过的化妆品活性物质的,生物学效应,,,了解表、真皮之间的相互作用将其他细胞,(,内皮细胞、白细胞,),引入真皮类似层,,,扩大测试系统,的使用范围皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,59,皮肤细胞的“三维培养”皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/,皮肤器官培养,,活体皮肤于体外培养，并使其保持其一定的结构和功能 培养方法,,液体浸没的皮肤器官培养,气,-,液面交界的皮肤器官培养,,,应用,化妆品对皮肤急性刺激毒性研究,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,60,皮肤器官培养 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/360,,在化妆品研发中的应用,,延缓皮肤衰老化妆品,,,,以皮肤ＫＣ和成纤维细胞为受试对象,,,寻找或筛,选具有抗衰老活性物质,,,确定该物质基本毒性情,况观察对两种细胞增殖能力及活性的影响,),,,研究外界因素对皮肤的药理学或毒理学作用如ＵＶ、药物及化妆品等,),,,将损伤作用作为模型进行化妆品的干预研究,,,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,61,在化妆品研发中的应用,皮肤美白产品,,,将活的黑色素细胞引入重建真皮类似环境，作为体外皮肤美白剂的初筛模型。
光生物学研究,,,如防晒剂的效果评价,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,62,皮肤美白产品皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/362,化妆品配方及成品的毒理学研究,,单层皮肤细胞培养,外来化学物的代谢及最初的刺激和过敏,反应皮肤三维培养,化妆品的细胞毒性、有效性研究及局部,应用化合物,(,药用化妆品、表面活性剂、渗,透剂和杀菌剂等,),效果评价皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,63,化妆品配方及成品的毒理学研究皮肤科细胞培养及临床应用2023,毛发用化妆品,,,,以毛根鞘上皮细胞为对象,,,进行护发活性物质的筛选以及毛发用化妆品毒性测试研究皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,64,毛发用化妆品 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/364,基础研究,,皮肤三维培养,(,重建表皮、真皮类似物,),---,化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性,研究,,---,重建表皮可用于研究表皮终末分化以及研,究表皮细胞分化调节物、表皮对刺激反应,机制；,化妆品经皮吸收和化妆品对屏障功,能的保护作用,,---,真皮类似物用来研究真皮层的组成及生理,功能,,---,重建表皮,+,真皮类似物,共培养系统用来研究,皮肤生理代谢、化合物的光毒性、ＵＶ效,应和防晒剂的作用,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,65,基础研究皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/365,体外细胞培养模型,,,角质形成细胞,黑色素细胞,朗罕氏细胞,成纤维细胞,皮脂细胞,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,66,体外细胞培养模型皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/366,细胞培养评估方法及指标,,,评估目的 细胞模型 评估指标,,毒性,2,3-,Ｄ细胞培养 细胞形态,,,细胞活性,,(,中性红,MTT,LDH,PEG2),,美白 黑素细胞培养 黑素的生成,黑素细胞和 酪氨到酶活性,角朊细胞共培养,,3-,Ｄ细胞培养,抗衰老 成纤维细胞培养 细胞增殖,,,胶原蛋白,,,,角朊细胞培养 弹性蛋白,,,3-,Ｄ细胞培养 粘多糖等的生成,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,67,细胞培养评估方法及指标皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/,在基因工程药物血药 浓度测定中的应用,,特定依赖细胞株培养法,,以药物对特定依赖细胞的增殖或抑制、细,胞数目的增减为量效指标。
细胞增殖法,:,促进特定依赖细胞株增殖,,,,抑制增殖法,:,抑制细胞增殖,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,68,在基因工程药物血药 浓度测定中的应用 特定依赖细胞株培养法皮,细胞培养量效指标的测定方法,,,[,3,H]-,胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法,(,3,H-TdR),59Fe,核素标记法,四氮唑盐法,(MTT),,直接计数法,其他间接法,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,69,细胞培养量效指标的测定方法 皮肤科细胞培养及临床应用202,细胞毒性的观察方法,,,放射性同位素摄入法,,3,H-,胸腺嘧啶,--,,3,H-,亮氨酸,--,培养基中掺入,3,H-,亮氨酸，根据,3,H-,亮,氨酸在细胞内含量测定细胞内蛋白质合,成情况 同位素法特点,揭示细胞分子水平的动态变化,,,是研究细胞代谢,状态的重要手段放射性损害需要特殊实验室和特殊设备四甲基偶氮唑盐比色法,(MTT,法,),,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,70,细胞毒性的观察方法 皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/3,,荧光染色法,,,乙酰乙酸荧光素法,,当细胞受到损伤时,,,细胞膜的选择通透性,屏障作用消失,,,利用乙酰乙酸荧光素和溴化,乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。
在,荧光显微镜下迅速区分受损细胞皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,71,荧光染色法皮肤科细胞培养及临床应用2023/,,发光细胞活力测试,,采用一种独特的、稳定性荧光素酶来检测有活力,细胞荧光素酶利用荧光素、氧和,ATP,作为反应底,物，产生氧化荧光 素，并以光的形式释放能量由,于荧光素酶反应需要,ATP,，因而反应产生光的总量,和反映有活力细胞数的,ATP,总量呈正比产生的发,光信号和培养基中的有活力细胞数呈正比特点,适用于高通量应用，测试大批量样品可快速得到,结果需要特殊的发光仪或,CCD,相机读取发光信号皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,72,发光细胞活力测试 皮肤科细胞培养及临床应用,流式细胞光度术,(FCM,法,),,,利用鞘流原理,,,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单,列,,,按重力方向流动细胞被激光照射后发射荧光,,,检测,器可逐个对细胞的荧光强度进行测定特点,对细胞测定能力为,30-60,万个细胞,/,分钟,,,同时可对细,胞的核酸,,,蛋白质酶、细胞周期分布等八种参数进行,测定皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,73,流式细胞光度术(FCM 法) 皮肤科细胞培养及临床应用202,在药物开发中的应用,药物筛选模型,整体动物水平,组织器官水平,细胞分子水平,细胞分子水平药物筛选模型,细胞系的生物学特征较为一致，用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，判断药物疗效及其毒性。
材料用量少，药物作用机制较明确，实现大规模筛选，缩短新药筛选周期皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,74,在药物开发中的应用药物筛选模型皮肤科细胞培养及临床应用202,,模型优势,,大样本量的筛选,(,扩大筛选对象和范围,),一药多筛,(,样品量少，珍贵药物多模型筛选，,扩大新药范围,),高通量药物筛选,(HTS),,计算机控制的自动化大规模筛选体系利用细胞培养制出的新药,,基因工程药物,细胞工程药物,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,75,模型优势皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/3,细胞培养中的药物试验问题,细胞的选择 敏感株,原代 细胞,性别系,(,株,),,,药物的溶解和保存 溶剂的选择,,药物剂量 半效剂量,(ID50),,选择合适指标粗略估算法,借用药物,LD50,精确计算,,药物作用时间 接种后约第,48,小时,(,指数生长期,),,时,-,效曲线,,,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,76,细胞培养中的药物试验问题皮肤科细胞培养及临床应用2023/9,思考题,,1.,应用细胞培养技术进行实验研究中细胞,生长、活力及细胞毒的测定方法,,2.,角质形成细胞体外生长特点,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,77,思考题皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/377,,谢 谢！,皮肤科细胞培养及临床应用,2024/8/28,78,谢 谢！皮肤科细胞培养及临床应用2023/9/378,。