免 疫 沉 淀 (Immunoprecipitation)实验操 作方法免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法 实验原理：免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是利用抗 原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如 protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白(抗体)样品准畐.样吊预蓿扌先FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原 的方法目前多用预先结合固化在Agarose beads 上的 protein A/G( Agrose-proteinA/G), 使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而 形成Agrose-proteinA/G、抗体、抗原复合物， 利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异 分离富集目的抗原抗体航膜孵育 1>沉淀反应 ►电泳分析实验步骤：1. 处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好 细胞模型一般3X106细胞/处理（即六孔板一 个孔，约200ug总蛋白）2. 配IP裂解液：200U/孔（6孔板），并加入蛋 白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结 果则应加入磷酸酶抑制剂注意抑制剂的要现 加现用3. 收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1XPBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液， 冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管 中。
4. 超声：强度37%, 5秒X4次（程序07）目 的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但 可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免 疫沉淀实验时要注意这一点5. 离心细胞裂解液：4度10000rpm 10分钟6. Agrose-proteinA/G 清洗：一般 1ug 抗体对应 15ul Agrose-proteinA/G （不同公司产品可能 不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的 Agrose-proteinA/G 用量与 结 合 抗 体 的 用 量 一 致 取 相 应 量 的Agrose-proteinA/G 到 EP 管中（剪枪头）并 用 5O0U11XPBS （4 度）洗两遍，5000rpmX 2 分钟，吸掉上清备用7. 细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞 裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗转移 步骤5离心好的细胞裂解液上清至步骤6洗好 的Agrose-proteinA/G中，4度翻转1小时8. 抗体和Agrose-proteinA/G预孵育：为减少游 离抗体消耗抗原造成IP效率下降，将抗体和 Agrose-proteinA/G进行预孵育。
在步骤6洗 好的 Agrose-proteinA/G 中加入 200ul 含 0.1%BSA的IP裂解液及相应量的抗体，4 度翻转1小时不同抗体时间可能有不同9. 抗原抗体孵育：步骤 7和8后进行离心（5000rpm 2分钟），将预清洗好的细胞裂解液转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G的EP管中，4度孵育过 夜10. 洗IP复合物：步骤9后离心（5000rpm 2 分钟），吸掉上清，加入IP裂解液（一般不用 加抑制剂）500 ul，弹匀后4度摇转5分钟， 重复6次最后一次离心后加入3XSDS 60ul11. WB 检测附注：IP lysis bufferTris50 m M PH 7.4NaCl:150m MEGTA2m MEDTA1 m MTriton X-100 1%磷酸酶抑制剂：Pyrophosphate 2.5m MGlycerol phosphate 1m MNa3VO4 1m M蛋白酶抑制剂：PMSF 1m MLeupeptin 1ug/mlAprotinin 5ug/mlIP lysis bufferReagentFinal concentrationQuantityTris-base (FW 121.1)50mM0.6055gNaCl (FW 58.44)150mM0.8766gEDTA(0.5M)1mM0.2mlTriton1% 1mlHCl (FW 36.46)adjust to pH7.4ddH2OMake up to 100mlNaF(FW:42g/mol) 50mM*50 0.105g/ml 焦磷酸钠(265・9g/mol) 2.5mM *100 0.067g/ml。