. . . 题目基于广谱性单克隆抗体的有机磷农药多残留免疫检测方法的研究3 / 72A Dissertation Submitted to Northwestern Polytechnical University for the Master DegreeDevelopment of Immunoassays for Multiple Residues of Organophosforus Pesticides using Monoclonal AntibodiesAuthor:Su JingSpecialty:Biomedical EngineeringSupervisor:Prof. Xue XiaopingTutor:Dr.Yang HuiFaculty of Life SciencesNorthwestern Polytechnical UniversityXi’an Shaanxi, P. R. ChinaMarch, 2009摘 要近几十年来，有机磷农药(Organophosphorus Pesticides,OPs)在农业与畜牧业中得到广泛应用。
与此同时，由农药残留引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注 仪器分析法是对有机磷农药残留检测中最经典、最常用的技术，主要采用色谱方法，包括：薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱－质谱联用（GC－MS）和高效液相色谱－质谱联用（HPLC－MS）等技术这些传统的方法具有灵敏可靠的优点，但是，它们也存在一些明显的不足：成本高、需要昂贵的仪器设备和专业的分析人员，样品准备程序复杂，并且不利于现场操作因此，迫切地需要建立一种简单、快速、灵敏、价廉，并能够适用在实验室和现场进行大批量的检测和筛选试验的检测技术免疫检测法是基于抗原抗体特异性识别和结合反应的是一类新的快速、敏感简便的检测方法，能够满足以上要求，从而日益受到人们的重视传统的农药残留免疫检测技术只针对某一种特定的农药残留进行分析本文基于实际应用中常采取多种农药混合搭配使用的特点，以与原药母体结构密切相关的类似物作为通用性半抗原，将通用性半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联，分别合成免疫原和检测抗原，免疫小鼠，制备、筛选出一种能识别一类或几类具有相似结构的有机磷杀虫剂的广谱性鼠源性单克隆抗体（mAb），以达到对多农药残留同时检测的目的。
本研究中所制备的抗有机磷组特异性单克隆抗体的效价为1×106（间接ELISA实验），参考工作稀释浓度为1:16000利用间接竞争性ELISA法对几种有机磷农药：乙基毒死蜱、甲基对硫磷、辛硫磷和三唑磷的标准品进行检测，绘制出竞争抑制曲线结果表明：由于农药化学结构的不同，检测灵敏度有一定的差别；其中对乙基毒死蜱检测灵敏度较高，最低检测限（LOD）为4ng/mL，对甲基对硫磷的LOD为63ng/mL而辛硫磷和三唑磷的化学结构与半抗原差别较大，检测敏感度低、一致性差胶体金免疫层析技术（Gold immunochromatography assay, GICA）是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术该方法无需精密检测仪器以与专业的实验操作人员，可以在很短的时间完成现场检测它的原理是：以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫结合反应，层析过程中形成的免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），运用可目测的标记物(胶体金)能够直观的观察检测结果(显色条带)，也可以借助专用检测设备判读检测结果。
本文在已制备出抗一类有机磷农药的组特异性单克隆抗体的基础上，又通过鞣酸—柠檬酸三钠还原法制备出直径16.08±0.64nm、质地均一的胶体金，并且以此标记单克隆抗体，组装胶体金免疫层析检测板，从而快速地对上述有机磷农药进行检测结果表明：该检测板对乙基毒死蜱具有较好的检测灵敏度，LOD为：4μg/mL，检测时间为5分钟最后，利用酶免疫检测法和胶体金免疫层析检测板对添加乙基毒死蜱的蔬菜、水果、土壤、自来水等模拟样本中进行实验检测，以评价不同样品基质是否对这两种检测方法存在干扰以与干扰程度结果表明：样品基质对酶免疫检测法的检测灵敏度有一定的影响，乙基毒死蜱标准品回收率在70%-90%之间；而对胶体金免疫层析检测板的检测灵敏度基本无干扰，最低检测限没有改变关键词：有机磷农药、多种残留检测、单克隆抗体、胶体金免疫层析AbstractIn recent decades, Organophosphorus pesticides (OPs) are widely used in agricultural and domestic settings. For analysis of OPs, the traditional methods, thin-layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and Gas chromatography (GC), with high sensitivity and specificity are laborious and expensive. Therefore, there is growing demand for more rapid and economical methods for determining pesticide residues. Immunoassays that can meet such demands have recently emerged as a fast, sensitive, and cost-effective alternative to the traditional methods.Although most of the immunochemical assays developed for the determination of pesticides are aimed at detecting individual pesticides, the mix of a variety of pesticides is usually applied in field. This paper selected a generic Hapten that has a O,O-Diethyl thiophosphate group common in OPs and conjugated the Hapten to BSA and OVA respectively to generate an immunogen and a coating antigen. An immunoassay for class-specific determination of OPs using monoclonal antibodies (mAb) against the Hapten was developed.The titer value of the mAb was 1×106 by indirect enzyme linked immunosorbant assays (ELISA), while the optima dilution for ELISA was 1:16000. The mAb showed desirable properties for use in determination by indirect competitive ELISA. The limit of detecting (LOD) value of Chlorpyriphos-ethyl was 0.004μg/mL. The LOD value for parathion-methyl was 0.063μg/mL.Gold immunochromatography assay (GICA) is based on the distribution of molecules in a biphasic system. For test, an aqueous sample and the labeled antibody migrates by capillarity to the test zone. The binding of labeled antibody to immobilized antigen on solid phase leads to the accumulation of colloidal gold and then a red color can be observed rapidly by naked eyes. There are no need for fussy operations as incubation, washing and enzymatic reactions which distinctly shorten the detection time. Especially, the results can be read directly by naked eyes, which are more suitable for assays on-site.This paper prepared uniform colloidal gold particles with a diameter of 16.08±0.64nm by the Tannin-sodium citrate reduction method, labeled mAbs with this nano-gold and then constructed immunochromatographic(IC) testing boards. The IC testing board was validated to complete a detection assay within 5 minutes, and the LOD value of Chlorpyriphos-ethyl was 4μg/mL.To evaluate the interferences from components in variously environmental matrix, samples of fruits, vegetables, tap water and soil spiked with Chlorpyriphos-ethyl were test. The results showed that the pesticide could be detected and no interference was observed in the real samples.Key words:organophosphorus pesticides, multi-residue detecting, monoclonal antibody, gold immunochromatography assay目 录第一章绪论11.1有机磷农药使用现状与危害11.2有机磷农药残留检测方法与快速检测技术的研究现状21.2.1色谱法21.2.2快速检测法31.3农药残留酶免疫分析技术的国外研究现状51.4胶体金免疫层析技术的研究进展6第二章抗原合成与单克隆抗体的制备92.1材料与方法102.1.1 主要试剂与仪器102.1.2 实验动物112.1.3 溶液系统112.2 实验方法122.2.1半抗原合成122.2.2人工免疫原与检测抗原的制备132.2.3 人工免疫原与检测抗原的鉴定142.2.4 杂交瘤细胞株与单克隆抗体的制备152.2.5 单克隆抗体鉴定152.3 实验结果与分析162.3.1 半抗原合成162.3.2人工免疫原与检测抗原的制备与鉴定172.3.3 杂交瘤细胞株与单克隆抗体的制备202.3.4 单克隆抗体的纯化与鉴定212.4 讨论23第三章有机磷农药多残留检测研究－竞争性酶联免疫吸附实验273.1 材料283.2实验方法283.2.1抗体、抗原最佳工作浓度选择283.2.2间接竞争ELISA检测方法标准曲线的建立283.2.3样品添加回收率测定293.3实验结果与分析293.3.1抗体、检测抗原最佳工作浓度293.3.2间接竞争ELISA检测方法标准曲线的建立303.3.3样品添加回收率313.4讨论32第四章有机磷农药多残留检测研究－（2）胶体金标记侧向流免疫检测技术354.1 材料364.2 实验方法364.2.1 胶体金制备364.2.2 胶体金标记单克隆抗体364.2.3胶体金单克隆抗体结合物的免疫反应性鉴定374.2.4紫外－可见光谱扫描374.2.5 荧光光谱分析374.2.6 电镜鉴定374.2.7 DLS 分析384.2.8 侧向层流胶体金免疫试纸条的制备384.2.9胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应384.3 实验结果与讨论394.3.1胶体金单克隆抗体结合物的免疫性394.3.2紫外－可见光谱扫描结果404.3.3荧光光谱分析404.3.4电镜鉴定414.3.5 DLS分析424.3.6胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应434.4 讨论44第五章小结47参考文献49发表论文和参加科研情况说明54致55缩略语表英文全称英文简称中文全称AntigensAg抗原AntibodiesAb抗体Bovine serum albuminBSA牛血清白蛋白Colloidal goldCG胶体金DicyclohexylcarbodiimideDCC二环己基碳二亚胺dynamic light scatteringDLS动态光散射dimethylformamideDMF二甲基甲酰胺Enzyme immunoassayEIA酶免疫分析Enzyme-linked immunosorbent assaysELISA酶联免疫吸附实验Gas chromatographyGC气相色谱High performance liquid chromatographyHPLC高效液相色谱Horseradish peroxidaseHRP辣根过氧化物酶ImmunochromatographyIC免疫层析Mass spectraMS质谱Monoclonal antibodiesmAb单克隆抗体N-hydroxy-succinamideNHSN-羟基琥珀酰亚胺OvalbuminOVA卵清蛋白Polyclonal antibodiespAb多克隆抗体Phosphate buffered salinePBS磷酸盐缓冲盐水Transmission electron microscopeTEM透射电镜Thin layer chromatographyTLC薄层色谱Tetramethyl benzidineTMB四甲基联苯胺Ultra-violet/visible spectrumUV-Vis spectrum紫外-可见光光谱第一章 绪 论1.1有机磷农药使用现状与危害在现代农业生产中，农药以其快速、高效、经济等特点，成为农作物病虫害综合防治的重要手段，迄今为止没有其它手段可以完全代替。
与此同时，也带来日益严重的化学农药残留污染问题，残留农药通过污染自然环境、生物富集和食物链在动植物体积贮，最终造成人类急性或慢性中毒随着人类物质生活水平的提高，农药残留的污染问题已引起普遍关注，各国对各种农副产品中农药残留都规定了越来越严格的限量标准在世界贸易一体化的今天，某些发达国家以农药最高残留限量为技术壁垒，限制对我国农副产品的进口严重污染食品的农药主要是有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类的杀虫剂和除草剂世界上农药常用品种约500种，我国的农药品种只有200多种有机磷农药已有70多年的使用历史，并仍被广泛使用常用的有机磷农药有乐果、氧化乐果、甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷等由于有机磷农药对于防治农业病虫草害具有经济、高效、方便等特点,使其在农药中占有重要地位，并且在今后相当长一段时间仍被广泛使用但是由于有机磷农药的高残留性，已经引起社会的高度重视，也制定了较为严格的限量标准，如有机磷农药在蔬菜中的最高残留国家标准根据美国《食品质量保护法》的规定，有机磷农药被美国环保局列为首先接受再登记和残留限量再评价的一类农药其中批准登记的有40种，久效磷、速灭磷等有机磷农药已被严格禁止施用。
有机磷农药主要抑制酯酶系统，特别是位于突触和红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶以与血浆中的丁酰胆碱酯酶虽然急性丁酰胆碱酯酶受抑制不引起显著的临床症状，但乙酰胆碱酯酶的抑制，可导致乙酰胆碱大量蓄积，刺激位于自主神经系统、中枢神经系统和神经-肌肉连接处突触的乙酰胆碱受体，产生以下四类临床症状：毒蕈碱样症状，包括支气管痉挛、气道分泌物增加、瞳孔缩小、流泪、流涎、呕吐、腹泻、尿失禁、低血压、心动过缓；烟碱样症状，有心动过速、瞳孔扩大、高血压、出汗；中枢神经系统症状，嗜睡、激惹、昏迷、呼吸衰竭；神经肌肉接头烟碱样症状有肌无力、瘫痪、肌束震颤有机磷农药可通过皮肤进入人体，在喷洒过程中产生的气雾可由呼吸道吸入，误服者可由消化道吸收急性有机磷农药中毒在我国非常多见,特别是在乡村地区县医院，几乎占急诊病人的1/10以上其原因在于我国是农业大国，有8-9亿人口在农村，另外，我国也是农药大国，几乎农用杀虫剂均含有机磷成分在生产过程中，因防护措施不力与农药容易获得、不易有效控制而常被用于自杀这导致有机磷农药中毒成为所有中毒事件中最为常见的一种，而且危害极大鉴于农药残留对人体健康危害极大，研究农药残留快速、高效的检测方法，加强食品中农药残留量的检测和监督管理对保证食品安全和人民生命健康具有重要意义。
1.2有机磷农药残留检测方法与快速检测技术的研究现状我国农药残留分析检测始于上世纪50年代，其分析步骤一般包括样品的采集和保存、农药的提取和浓缩、试样的净化、农药的定性定量分析等最初的农药残留检测技术仅限于化学法、比色法和生物检测法，这些方法灵敏度低且缺乏专一性20世纪60年代气相色谱法（GC）应用于农药残留分析,大大提高了农药残留的检测水平，20世纪80年代以来，高效液相色谱法开始广泛应用于对热不稳定和离子型农药与其代物的分析，色谱法虽然定量准确、灵敏度高，但所需设备昂贵，需要专业人员操作，且分析时间长不利于现场监测近几年来，随着技术的不断进步，越来越多的分析检测方法涌现[1,2]，目前用于有机磷农药残留的检测方法主要有两大类──农药残留快速检测法和色谱检测法农药残留快速检测法是一类快速检测农药残留的方法，主要用来阻止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留严重超标的蔬菜和水果流入市场1.2.1色谱法（1）薄层色谱法（TLC）薄层色谱法无需特殊设备，简便易行，可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和筛选TLC通过使用特殊的显色剂观察斑点颜色以与使用Rf值进行定性检由于该方法灵敏度不高，近年来很少使用，多作为分离手段。
2）气相色谱法（GC）气相色谱法（GC）具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点，是目前应用最多的方法，占有关色谱法报道的70%以上凡是易气化、气化后又不发生分解等现象的农药均可采用气相色谱法检测我国食品理化检验国家标准方法采用了气相色谱检测有机磷农药，检出限为1ng[3]近年来，气相色谱联用技术发展迅速其中，气相色谱—质谱联用技术（GC-MS）得到了广泛的应用[4]它既有气相色谱的高分离性能，又有质谱准确鉴定化合物结构的特点，可达到同时定性、定量的目的，在农药代物和降解物检测方面具有突出优点3）高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法（HPLC）可以分离与检测极性强、分子量大或离子型农药，尤其对不易气化或受热易分解的化合物更能显示出它的突出优点近年来，采用高效色谱柱、高压泵和高灵敏度的检测器、柱前或柱后衍生化技术以与计算机联用等，大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度，现已成为农药残留检测不可缺少的重要技术，其缺点是溶剂消耗量大，检测器种类较气相色谱少，灵敏度不如气相色谱高1.2.2快速检测法（1）酶抑制法酶抑制法是一种相对成熟的快速检测技术，适合现场检测与大批样品的筛选。
在一定条件下，有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的活性有抑制作用，因此可以利用农药靶标酶-乙酰胆用碱酯酶受抑制的程度来检测有机磷农药该法无须昂贵的仪器，操作简便快速，但灵敏度较差，重复性、回收率还需要进一步的提高很多学者利用乙酰胆碱对农药残留快速检测进行了大量研究，并开发了许多快速检测方式或方法通过酶抑制率判定蔬菜、果品与农产品中农药残留的存在情况利用纸片或电极作为载体将酶吸附，并制成速测箱，是一种快速、灵敏、经济的现场检测手段近年来，酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段，美国堪萨斯研究所开发出一种称为农药检测器（Detector）的“酶片”（Enzyme Ticket），该酶标签对乙酰胆碱酯酶的抑制剂灵敏，可用于测定水中有机磷和氨基甲酸酯农药，检测限在0.1～10mg/kg[5]近年来，我国自行研制的农药速测仪正向着体积小、重量轻、便携式、灵敏度高、重现性好、经济、简便、自动化程度高的方向发展元光等成功研制了有机磷农药现场快速检测仪，该仪器响应时间为3 min，对敌敌畏、对氧磷的线性检测围分别为0.5～43.1μg/mL和0.1～15.0μg/mL[6]2）化学发光技术化学发光法利用发光物质鲁米诺、光泽精、洛酚、没食子酸和过氧草酸等与有机磷农药进行特殊的化学反应，在反应中吸收了释放出的化学能，而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时产生光辐射[7]。
其中鲁米诺是最有效的化学发光物质之一化学发光法通过4个参数：颜色、强度、产生速率与强度的衰减来表征pH值、试剂浓度等对发光强度也有很大的影响它具有灵敏度高，反应速度快，选择性好，仪器设备简单等优点,更适合现场监测工作的开展Roda等[8]采用流动注射-化学发光法检测了对氧磷、涕灭威等有机磷农药，其检测限分别是0.75、4.00 μg/L3）免疫分析技术免疫分析是一种灵敏、简便和快速的分析方法，已成为现代生命科学的重要研究手段，在许多学科中都有广泛的应用利用标记免疫分析技术的原理对农药进行检测和分析的各种方法统称为农药免疫分析近年来，农药免疫分析的研究得到了越来越多的农药研究工作者的重视，正在逐渐成为农药研究领域的一个热点[9]迄今应用到农药领域的免疫分析方法除了传统的放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析等外，还出现了流动注射免疫分析、免疫传感器技术等新方法4）生物传感器技术传感器技术现在已经广泛应用于医药、卫生等领域生物传感器通常指由生物敏感部件与转换器紧密配合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置相对于其他分析器件，生物传感器具有体积小、成本低、灵敏度高、选择性与抗干扰能力强、响应快等优点。
根据生物敏感元件的不同，生物传感器有酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、压电传感器、纳米传感器以与液晶型化学传感器等多种类型[10]酶生物传感器是将固定酶和电化学传感器结合在一起，在对有机磷的检测中，相对于其他分析器件具有体积小、成本低、选择性与抗干扰能力强、灵敏度高、响应快等优点，还可同时检测多个样品[11]，但是酶对底物具有高度专一性且稳定性较差酶生物传感器在食品检验中的应用相当广泛，检测有机磷的生物传感器是基于乙酰胆碱酯酶被一种或几种分析物的抑制作用进行检测电流乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作原理是：当乙酰胆碱酯酶的活性被农药所抑制，则水解产物的量会降低，电流将发生变化酶的抑制作用还可通过pH的测定进行检测，pH值的变化反映为酶活性（如产生的醋酸量）的变化样品中有机磷对酶活性的抑制作用反映为产生的醋酸量减少，从而可以通过玻璃电极进行测定Fernando[12]即采用光寻址电位型传感器测定了有机磷类农药，生物敏感材料为鳗鱼乙酰胆碱酯酶，可检测出10mmol/L的马拉松和恶虫威，对其它农药如久效磷、百治磷、敌敌畏、速灭磷等检测浓度更高些这种传感器检测速度快，几分钟可同时检测8个样品免疫传感器将抗原（或抗体）固定在载体上，可以很方便地与未反应的抗体（或抗原）分离，利用目标化合物与抗体的特异性结合，并利用转移器将这种特性结合转化成特定形式的反应信号，通过监视器把这些特殊信号变成可视数据，从而使免疫测定法自动化和小型化。
其优点是快速（几秒钟到几分钟）、灵敏度高和可逆性好，可实现对单或多种物质进行实时测定在以往的研究中，免疫传感器被用于分析包括农药分子在的多种有毒物质和污染物Wan等人研制了便携式的光纤免疫传感器检测甲基对硫磷，其最小检测限为0.1ng/mL[13]，Ayyagari[14]等研制开发的光纤免疫生物传感器用于测定样品中的对硫磷，较之色谱法，该法简便快速，分析周期明显缩短生物传感器已在环境监测、食品、医药等领域得到广泛应用但目前生物传感器技术还存在稳定性差，使用寿命短等问题1.3农药残留酶免疫分析技术的国外研究现状免疫分析是一种以抗原－抗体相互识别为基础的，灵敏、简便和快速的分析方法，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术近年来，免疫分析在农药残留检测中的应用得到快速发展，已被列为90年代优先研究、开发和利用的农药残留分析技术世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术美国化学学会将免疫分析技术、色谱分析技术（气相和液相）共同列为农药残留分析的主要技术，检测结果具有一样的法律效应[15]Centeno和Johnson(1967)有关制备兔抗滴滴涕和马拉硫磷抗体的报道，被认为是免疫学技术开始应用于农药分析的标志[16]。
在免疫分析技术中抗体是关键，早期研究中使用的是多克隆抗体（pAb），目前多使用单克隆抗体（mAb），这些mAb已涵盖了各种常见的化学杀虫剂，对抗有机磷农药mAb的研究也有许多的报道Hunto和Wie （1982）分别报道了对硫磷和除虫脲的酶免疫分析（EIA）检测此后，EIA和mAb被广泛应用于有机磷农药残留免疫分析的各个领域McAdem和Hill （1992）[16]制备了杀虫螟mAb，对谷物中的农药残留量的检测线性检测围达100～20000 ng/mLE.K.Lee等（2005）[17]制备了抗二嗪磷mAb，间接竞争ELISA检测极限达0.7ng/mLW.Y.Lee等（2006）[18]以抗异硫磷的mAb建立了ELISA，对异硫磷的检测极限为5.8ng/mL据不完全统计，国外研制的各类抗农药mAb有20多种以此为基础已研制出几十种农药的酶免疫试剂盒，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、三嗪类、拟除虫菊类与酰胺类等美国目前的ELISA试剂盒对有机磷类农药的最小检出值达20ppm，达到MRL（Maximum Residue Level）值的1/2在美国有关官方机构，如环境保护署（EPA），农业部食品安全检验司（FSIS—USDA）和AOAC已制免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则[19]。
我国虽然起步较晚，但在国家自然科学基金、“863”、农业部“984”引进项目基金等的大力支持下，业已有了长足的发展，取得了一批研究成果据《中国计量》报道[20]，2005年12月24日，“十五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题“农药残留检测技术研究”通过了由国家质检总局科技司和科技部农村与社会发展司组织的有关专家的验收，建立了粮谷、茶叶、果蔬、果汁等农产品中有机氯、有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机杂环类等150种以上的农药残留量检测方法31个；成功研制开发出酶抑制法、酶联免疫法、胶体金免疫法等农药残留快速检测试纸条、速测卡、试剂盒共计24个与国外相比，国已制备成功的抗化学杀虫剂mAb的种类尚不多，公开报道的主要有如下几种长武等（1992）[21]首先报道研究了杀虫剂对硫磷的抗体余万俊等 [22]用自制的杀虫脒人工抗原免疫BALB/c小鼠，制备出抗杀虫脒的mAb，经间接竞争ELISA证实，制备的mAb对杀虫脒具有很高的特异性，为建立杀虫脒的免疫分析法打下了基础王刚垛等（1995）[23]，用人工抗原E600-BSA免疫BALB/c小鼠，成功的建立了能分泌抗对氧磷mAb的杂交瘤细胞株。
随后（1999）他们又以同样的方法制备了抗甲基对硫磷（M1605）mAb，建立了间接竞争抑制ELISA法检测血中M1605，检测围5~500ng/mL，最低检测质量浓度5ng/mL，与M1605结构相似物对氧磷和对硫磷无交叉反应，为型特异型mAb[24]颜春荣等（2003）[25]利用氟虫腈类似物FH作为半抗原，制备mAb，建立的间接竞争ELISA方法对氟虫腈最低检测浓度为0.074 ng/mL，抑制中浓度为5.99 ng/mL与定虫隆、三氟氯氰菊酯、氟乐灵、氟虫脲的交叉反应率小于0.67 %肃清等（2003）[26]报道成功制备了抗甲氨磷的mAb许艇等（2004）[27]成功制备氨基甲酸酯类杀虫剂—甲萘威mAb，ELISA法的最低检测限为4.1 ng/mL，抗体与克百威和叶蝉散的交叉反应分别是4.6%和1.69%；与灭多威、涕灭威与甲萘威的主要有毒代产物α萘酚的交叉反应均小于0.1%朱江等（2006）[28]以人工合成溴苯腈免疫原，制备mAb交叉反应试验表明，与其他苯腈类农药交叉反应率低于10%，溴苯腈检测限为10μg/kg1.4胶体金免疫层析技术的研究进展免疫层析试纸法作为一种方便、快速、低成本的检测方法，已用于许多生物学标记物的定性检测。
此法是将特定抗原或抗体的耦联物固定在膜表面，再通过水相介质在膜孔中的毛细作用，将与其对应的标记抗体或抗原探针运送到固定部位目前，在众多标记物中，胶体金越来越受到研究者的青睐胶体金是氯金酸在还原剂作用下聚合成的金颗粒，其特点是：根据需要可制备大小不同的金颗粒（直径在1～150 nm之间）颜色呈桔红色到紫红色，具有高电子密度、介电特性和催化作用能与多种生物大分子结合且不影响其生物活性1962年Feldherr第一次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪标记物Faulk [29]把胶体金引入免疫化学这一年被公认是免疫胶体金技术诞生的一年与荧光标记物和酶标记物相比，胶体金更加稳定，并且不需要诸如孵育、洗板、酶反应等一系列耗费时间的程序在检测中，胶体金随着抗原抗体的结合，在固定部位蓄积，从而迅速显现出紫红色这项性质显著缩短了检测时间，并且可以方便地进行现场检测Beggs等[30]于1990年将含有胶体金-抗HCG-单抗络合物制备免疫层析试纸条检测样品中的HCG，1991年Horton等[31]利用胶体金标记的羊抗鼠IgG检测鼠IgG，Hwa等[32]用三种材料制作层析膜，标记有胶体金的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体（5E11）通过毛细作用与硝酸纤维素膜上检测区的抗蓖麻毒素B的单克隆抗体（1G7）反应呈红色。
整个检测过程时间不到10分钟，可检测到的蓖麻毒素的浓度为50ng/mL如用银做标记物，可将灵敏度提高到l00pg/mL我国对胶体金免疫层析技术的研究报告最早发表于1996年，捷平等[33]报道采用双单克隆抗体的免疫层析一步法检测无需分离步骤，可在2~5分钟得到结果，最低检测限在25IU/L，方便迅速近年来随着对此项技术研究的不断深入，其应用领域也不断扩大对于小分子化合物的胶体金免疫层析技术目前已在检测毒品方面得到广泛的应用，并已初步应用在食品安全以与农药检测方面Zhou Pei[34]（2004）发表了采用此方法对有机磷农药克百威进行检测的研究报道，检测灵敏度达250μg/L从上述文献报道中可以得出这样的结论，胶体金免疫层析检测技术具有敏感、快速、稳定等特点，这些优点正是我们在研究化学农药多残留检测中所需要和追求的但截至目前为止，在公开发表的文献中，尚未见到利用胶体金免疫层析检测技术进行农药多残留检测的研究报告第二章 抗原合成与单克隆抗体的制备大多数对农药的免疫化学检测法都只针对一种特定的农药混配农药的生产和使用，以与环境和食品中农药多残留检测的需要，给农药的免疫化学检测方法的研究提出了新的挑战。
如何将单克隆抗体检测围扩大，从而直接检测出具有共同基团的一类农药，逐渐引起研究者的关注Banks[35]等人曾利用有机磷农药的保守结构合成半抗原，制备具有广泛特异性的多克隆抗体，但此种抗体缺乏灵敏性其后，Johnson[36]以与Alcocer[37]等人在抗体的敏感性方面做了重要改进，但是对分析物的反应缺乏一致性目前，此项研究在国尚不多见免疫分析检测法的核心是抗原抗体反应，由于有机磷农药属半抗原，不具有免疫原性，它必须与其它大分子物质结合后才具有免疫原性，才能用于制备抗体蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质（如酶、蛋白、毒素等）以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等此方法首先发展于人工抗原的制备研究自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质如化学药物、神经递质和激素等半抗原与于蛋白质和多糖等载体大分子共价结合，使其具备免疫原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析、酶标免疫技术等为了使上述免疫分析方法达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质方法进行了大量研究，建立了重氮化法、戊二醛法，混合酸酐法以与活泼酯法等。
混合酸酐法过程简单，无需制备和分离中间产物[38,40]反应式为：活泼酯法是对碳二亚胺法的改进，由于消除了碳二亚胺对蛋白质的直接作用，从而避免了蛋白质分子间的交联[41]反应式为：单克隆抗体简称单抗，是由单一B细胞骨髓瘤细胞产生的抗单一表位的高度特异性抗体1975年Kohler和Milstein首创了小鼠B淋巴细胞和杂交瘤细胞的单克隆抗体技术，基本原理是：分泌特异性抗体的B淋巴细胞不能在体外生长，而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞这种杂交瘤细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异性单克隆抗体单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：1.单一特异性，与一个抗原决定簇反应；2.可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；3.一经制出，可无限量地供应；4. 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；5. 能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分2.1材料与方法2.1.1 主要试剂与仪器4-羟基-2-甲基苯甲酸Sigma纯度98%二乙基-氯-硫代磷酸盐农药厂惠赠纯度98%牛血清白蛋白(BSA)Roche纯度95%卵清蛋白(OVA)Roche纯度90%二环己基碳二亚胺（DCC）SigmaN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）Sigma三正丁胺Sigma氯甲酸异丁酯化学试剂厂分析纯二甲基甲酰胺(DMF)化学试剂厂分析纯3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)Roche生物技术弗氏完全佐剂SigmaPEG1500Roche透析袋Sigma680型酶标仪Bio-Rad紫外分光光度计U-3310HITACHI凝胶成像系统Bio-Rad超纯水机Milli-Q18.3MΩ冻干机1-2/LD-2ALPHA电转移系统mini trans-blotBio-Rad电泳系统 mini protean systerm 3Bio-RadHATSigmaHTSigmaRPMI 1640Gibco鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒Sigma辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG中杉金桥2.1.2 实验动物八周龄雌性BALB/c小鼠（购于第四军医大学实验动物中心）。
2.1.3 溶液系统ELISA用主要试剂：（1）包被缓冲液：0.185 mol/L，pH9.6 的碳酸盐缓冲液； （2）洗涤缓冲液：PBST（含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，下同）；（3）封闭液：1 g BSA溶于100 mL洗涤缓冲液；（4）抗体稀释液为PBST；（5）底物缓冲液：pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液；（6）显色液A液：8μL 3%H2O2加入5mL底物缓冲液中，混匀，B液：1mg四甲基联苯胺（TMB）溶于1ml无水乙醇，加底物缓冲液5mL；（7）终止液：2 mol/L H2SO4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳主要试剂：（1）30%胶贮液：丙烯酰胺290g，双丙烯酰胺10g，溶于去离子水，定容至1L；（2） 4×分离胶缓冲液（1.5 M Tris-HCl，pH 8.8）：18.2 g三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）溶于80mL去离子水，用浓HCl调pH 8.8，加去离子水定容到100mL，4℃贮存；（3）4×堆积胶缓冲液（0.5 M Tris-HCl，pH 6.8）：6g Trisbase溶于80mL去离子水，用浓HCl调pH 6.8，加去离子水定容到100mL，4℃贮存；（4）10×电泳缓冲液（pH8.8 Tris-Gly）：30.3 g Trisbase，144g甘氨酸，加去离子水定容到1L，4℃贮存；（5）2×溴酚蓝上样缓冲液：1.25mL pH6.8，0.5M Tris-Cl，3.0mL甘油，2mL 0.5%溴酚蓝，5.5mL去离子水，-20℃贮存；（6）10％过硫酸铵（APS）；（7）0.25%考马斯亮蓝染色液R-250：Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，去离子水450mL；（8）脱色液：100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL去离子水；（9）17%分离胶（10mL）：30%胶贮液4.25mL，4×分离胶缓冲液（1.5 M Tris-HCl，pH 8.8）2.5mL，去离子水3.2mL，TEMED 15μL，10％APS 35μL；（10）4%堆积胶（5 mL）：30%胶贮液0.5mL，TEMED 15μL，去离子水3.2mL，10％APS 35μL，4×堆积胶缓冲液（0.5 M Tris-HCl，pH 6.8）1.25mL。
Western免疫印迹主要试剂：（1）转膜缓冲液：2.375gTrisbase，11.25g甘氨酸，200mL甲醇，加去离子水定容至1L，4℃贮存；（2）洗涤缓冲液：同ELISA；（3）显色液：增敏二氨基联苯胺（DAB）2.2 实验方法2.2.1半抗原合成如图2-1所示，1.35g 4-羟基-2-甲基苯甲酸溶于硫酸/甲醇（1:10）中，逆流24小时，蒸发，残余过柱层析（硅胶，己烷:乙酸乙酯=2:1， TLC: Rf 0.54）将上述产物（1）0.26g溶于3ml丁酮加入0.5g二乙基-氯-硫代磷酸盐，以与5g精细研磨的碳酸钾，混合物在80℃搅拌24小时，然后硅藻土过滤.滤液浓缩，上柱层析（硅胶，己烷:乙酸乙酯=5:1，TLC: Rf 0.48）再将产物（2）318mg溶于60mL乙醇，电磁搅拌下加入25mL1 M KOH，室温下继续搅拌30分钟；加入30 mL 1 N HCl，50mL乙酸乙酯萃取，20mL 1 N HCl洗涤有机层，无水硫酸镁干燥，待溶剂蒸发干净后，残余上柱层析（硅胶，己烷:乙酸乙酯:乙酸=200:100:8， TLC Rf 0.57）得到70mg半抗原（Hapten）。
图2-1半抗原的合成Figure 2-1 Synthetic routes for Hapten2.2.2人工免疫原与检测抗原的制备（1）混合酸酐法制备人工抗原取O,O-二乙基-O-（4-羟基-3-甲基苯）磷硫酰9.5mg、三正丁胺7.3 μL与氯甲酸异丁酯4μL，溶于0.5mL DMF（分子筛脱水）中，常温下避光搅拌40分钟将上述反应液于电磁搅拌下逐滴滴加到溶有40.5mgBSA或37mgOVA的3.5mL 超纯水中（含10%体积DMF），室温下搅拌2小时用1M NaOH调pH至8.5，室温搅拌3小时4℃下对2L超纯水透析两天，冻干其中Hapten与BSA的偶联物（Hapten-BSA）为人工免疫原，Hapten与OVA的偶联物（Hapten-OVA）为人工检测抗原2） 活泼酯法法制备人工抗原取9.5mgO,O-二乙基-O-（4-羟基-3-甲基苯）磷硫酰与6.3mg二环己基碳二亚胺（DCC）溶于0.5mL DMF（分子筛脱水）中，常温下避光搅拌10分钟，加入3.53mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），继续避光搅拌3.5小时离心后，将上清液在电磁搅拌条件下，逐滴滴加到溶有40.5mg BSA或37mgOVA的4mL 0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，pH8.0）中，常温下继续搅拌2小时，4℃下对2L超纯水透析两天，冻干。
其中Hapten-BSA为人工免疫原，Hapten-OVA为人工检测抗原2.2.3 人工免疫原与检测抗原的鉴定（1）紫外吸收光谱对偶联物进行分析用PBS溶解BSA、OVA、Hapten-BSA与Hapten-OVA，浓度为0.2 mg/mL用DMF溶解Hapten，浓度为0.2mg/mL将上述溶液置于U-3310紫外分光光度计（HITACHI）中进行波长扫描，扫描波长200~300nm，光程10 mm对上述0.2 mg/mL的Hapten做系列稀释，于波长扫描最大吸收峰处测定吸光度值，绘制吸光度值-浓度标准曲线，并利用此标准曲线分别测定Hapten-BSA与Hapten-OVA中Hapten，计算出分子偶联比2）人工抗原免疫原性鉴定用人工免疫原对8周龄BALB/c小鼠进行免疫，每种免疫原免疫三只小鼠初次免疫按每只BALB/c小鼠100μg Hapten-BSA（溶于100μLPBS）以1:1(v/v )的比例加入福氏完全佐剂，充分混合制成乳液，分多点注射于BALB/c小鼠颈背部皮下以后间隔两周追加免疫一次，方法为腹腔注射100μg Hapten-BSA（溶于100μLPBS，不加福氏佐剂），共追加免疫5次。
每次免疫后一周尾静脉采血，分离血清采用非竞争性间接ELISA法测定多克隆抗体的效价具体方法如下：1. 包被：在96微孔板每孔加入100 μL包被液，包被抗原Hapten-OVA浓度为100μg/mL，包被缓冲液稀释，4℃过夜或37℃温育1小时用洗涤液缓冲液洗涤三次，拍干2. 封闭：每孔加入100 μL封闭液，37℃温育1小时用洗涤液缓冲液洗涤三次，拍干3. 加一抗：将含多克隆抗体的血清系列稀释后，于每孔加入100 μL，留下一孔加未免疫的BALB/c小鼠血清作为阴性对照37℃温育1小时用洗涤缓冲液洗涤三次，拍干4. 加酶标二抗：每孔加入100 μL按1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，37℃温育1小时用洗涤缓冲液洗涤三次，拍干5. 显色：现配A液、B液，每孔各加50 μL，37℃温育10min6. 终止反应：每孔加入50 μL终止液7. 读数：立即用吸水纸吸干酶标板底部，将其置于酶标仪上，450nm波长下，以没有反应的空行为空白对照，测各值OD值，每组数据都以三次重复测得的平均值为准结果判断：以大于阴性对照孔OD值的2.1倍为阳性孔阳性孔中，多克隆抗体的最大稀释倍数为其效价。
2.2.4 杂交瘤细胞株与单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备：Hapten-BSA（1mg/L溶于PBS）以1:1（v/v）的比例加入福氏完全佐剂，制备乳液以100μL/只，皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，间隔两周，腹腔注射免疫原50μg/100μL PBS，追加免疫2次，末次免疫后3天，取小鼠脾细胞做细胞融合SP2/0细胞（2×107）与免疫鼠脾细胞（1×108）按1:5的比例混合[42]，加入PEG-1500融合，操作按PEG使用说明进行融合细胞点种于96孔培养板，在HAT培养基中选择培养，3天后半量换液一次，5天左右有细胞克隆形成，取培养上清用ELISA间接法和ELISA竞争抑制法检测单克隆抗体（mAb）效价和抗体特异性取抗体分泌阳性细胞，用有限稀释法做克隆化[42]，以获得可稳定分泌特异性mAb的单克隆杂交瘤细胞系扩大培养筛选出的单克隆株，使用BALB/c小鼠体诱生腹水的方法大量制备单克隆抗体[43-45]使用辛酸－硫酸铵法纯化单克隆抗体，SDS-PAGE鉴定2.2.5 单克隆抗体鉴定（1）单抗隆抗体亚型与效价测定单克隆抗体亚型鉴定采用间接ELISA法，检测试剂盒（sigma Co.USA），操作按使用说明进行。
抗体效价与参考工作浓度测定采用非竞争性间接ELISA法，操作见2.2.32）单克隆抗体特异性鉴定采用Western免疫印迹法对单克隆抗体特异性进行鉴定分别将BSA与两种方法制备的人工免疫原各10μL （1mg/mL）与等体积的loading buffer混合后上样，积层胶使用100V电压，分离胶120V电压电泳结束后，考马斯亮蓝R-250染色1小时，脱色液脱色后使用凝胶成像系统对凝胶进行成像记录电泳结束后进行转膜，方法如下：1.将非变性聚丙烯酰胺凝胶浸泡于电转膜缓冲液中，同时将两同样大小的whatman滤纸与两块海绵浸泡于缓冲液中2.剪一块同样大小的NC膜，浸泡电转膜缓冲液中至少30分钟3.组装电转膜治，顺序为：正极，海绵，whatman滤纸，NC膜，非变性聚丙烯酰胺凝胶，whatman滤纸，海绵，负极4.治夹子放入预装有电转缓冲液的电泳槽中，加盖，接通电源，100V，90分钟完成后的NC膜用去离子水冲洗，置于3%脱脂奶粉中，室温封闭1小时，用洗涤缓冲液冲膜3次，每次5分钟加1:50稀释的免。