实验二实验二 蛋白质含量蛋白质含量的测定的测定凯氏定氮法凯氏定氮法 一一 目的：目的：n学习凯氏定氮法学习凯氏定氮法测定蛋白质含量测定蛋白质含量的实验原理的实验原理n掌握蒸馏、滴定操作技术掌握蒸馏、滴定操作技术三聚氰胺C3N6H6 “蛋白精”二、原理：二、原理：蛋白质含N量约为16，测出含氮量推知蛋白含量消化：消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮-硫酸铵添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催硫酸铵添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂，后者提高硫酸沸点化剂，后者提高硫酸沸点CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十十4H2O十十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4蒸馏吸收：蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂变色液中的氢离子浓度降低，指示剂变色滴定：滴定：标准标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，根据所用标准酸的摩尔数为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩相当于待测物中氨的摩尔数尔数)，计算出样品中的总氮量。
计算出样品中的总氮量消化消化蒸馏、吸收蒸馏、吸收滴定滴定三、试剂与器材三、试剂与器材1、消化液：、消化液：H2O2：H2S04：H2O=3：2：12、粉末硫酸钾、粉末硫酸钾硫酸铜混合物硫酸铜混合物 K2S04与与CuS04.5H20以以 3：1混合混合3、30氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液4、2硼酸溶液硼酸溶液 5、标准盐酸溶液、标准盐酸溶液(约约0.01 molL)6、混合指示剂、混合指示剂(田氏指示剂田氏指示剂)由由50mL 0.1甲烯蓝乙醇溶液与甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存酸性时为紫红色，碱性时为绿色变色酸性时为紫红色，碱性时为绿色变色范围很窄且灵敏范围很窄且灵敏7、待测样品、待测样品四、操作方法四、操作方法1.消化前样品处理消化前样品处理 n固体样品固体样品:某一固体样品中的含氮量是某一固体样品中的含氮量是用用100g该物质该物质(干重干重)中所含氮的中所含氮的g数来数来表示表示()n固体样品固体样品105烘干至恒重烘干至恒重n用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。
室温后称重，按上述操作继续烘干样品每干燥每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重数值不变，即达恒重n若样品为液体若样品为液体(如血清等如血清等)，可取一定体，可取一定体积样品直接消化测定积样品直接消化测定2、消化消化n取凯氏烧瓶取凯氏烧瓶 标号各加标号各加几几颗玻璃珠颗玻璃珠;n1及及2号瓶中各加样品号瓶中各加样品0.1g，催化剂，催化剂200 mg，消化液，消化液5 mL3及及4号瓶中号瓶中各加相同量的催化剂和消化液各加相同量的催化剂和消化液-对照，对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物以测定试剂中可能含有的微量含氮物质消化开始时应控制火力，不使液体消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈待瓶内水汽蒸完，硫酸开冲到瓶颈待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出始分解并放出SO2白烟后，适当加强火白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色力消化，直至消化液呈透明淡绿色n 定容：冷却后，加蒸馏水定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加慢加，随加随摇随摇)将瓶中液体倾入将瓶中液体倾入50 mL或或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。
洗液并入容量瓶，定容加样时应直接送人瓶底，不加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上要沾在瓶口和瓶颈上3、蒸馏吸收：、蒸馏吸收：改进型凯氏定氮仪改进型凯氏定氮仪n 特点：将蒸汽发生器、蒸特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，体，体积小，安装容易，操作简便操作简便1)水蒸汽发生器和反应室水蒸汽发生器和反应室2)冷凝器和通气室冷凝器和通气室3)排水柱排水柱n关键：搞清水管系统关键：搞清水管系统蒸馏器的洗涤蒸馏器的洗涤n.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水一定量的水(以排水口高度为宜以排水口高度为宜)，酒酒精灯加热烧开精灯加热烧开n.水的自动喷出：水的自动喷出：n将蒸馏水从加样室加入反应室将蒸馏水从加样室加入反应室n将酒精灯移开片刻，反应室内水将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器自动喷出到蒸汽发生器n打开蒸汽发生器出水口，放水打开蒸汽发生器出水口，放水n 如此反复清洗如此反复清洗3-5次n.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有有5 mL，2硼酸溶液和硼酸溶液和12滴指示滴指示剂的混合液。
如不变色则表明蒸馏装剂的混合液如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净置内部已洗涤干净n 蒸馏吸收蒸馏吸收n准备准备:n取取50 mL锥形瓶锥形瓶3个，各加入个，各加入5 mL 硼酸溶液和硼酸溶液和1滴指示剂滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用皿覆盖备用n关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通将锥形瓶放在冷凝器下，关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没在液体内冷凝器下端浸没在液体内n加样加样:n移液管取移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒用小量筒加加NaOH溶液溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口关闭自由夹，少量水封口n蒸馏蒸馏:n关闭自由夹，打开冷凝水关闭自由夹，打开冷凝水n点燃酒精灯，点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约约2-3分钟分钟)开始计时，蒸开始计时，蒸馏馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏，继续蒸馏1分钟，取下锥分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。
形瓶，表面皿覆盖n蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述重复重复3次最后将自由夹同时次最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏4、滴定、滴定n全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点n注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林 n 滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！n 及时记录读数及时记录读数n要求：空白液要求：空白液1次，样品消化液次，样品消化液2次次5、计算、计算n总氮量总氮量 ()=c c为标准盐酸溶液摩尔浓度为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.00980.0098M)M)；V V1 1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mLmL数；数；V V2 2为滴定空白液用去的盐酸溶液为滴定空白液用去的盐酸溶液mLmL数；数；w w为样品重量为样品重量(1 1g)g)。
1414为氮的相对量子质量为氮的相对量子质量消化液总量消化液总量500500ml,ml,蒸馏时消化液用量蒸馏时消化液用量3 3ml ml 样品蛋白质含量样品蛋白质含量()=总氮量总氮量6.25注意事项n冷凝水的开、关n自由夹：中间n酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够n蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处n火焰n小心照看，防止反应液喷出n防止烧到橡胶管n冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污染n空白：蒸10分钟未变色，再蒸3分钟n铁架台：夹子口朝上思考题思考题n1、何谓消化？如何判断消化终点？、何谓消化？如何判断消化终点？2、在实验中加入粉末硫酸钾、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？硫酸铜混合物的作用是什么？3、固体样品为什么要烘干？、固体样品为什么要烘干？4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？5、如何证明蒸馏器洗涤干净？、如何证明蒸馏器洗涤干净？6、本实验应如何避免误差？、本实验应如何避免误差？。