PCR 及 RT-PCR 概述一、目的掌握聚合酶链式反应 (PCR) 及逆转录－聚合酶链式反应 (RT-PCR) 的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板 DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧反应时它包括三个基本步骤 : (1) 变性 (Denature):目的双链DNA 片段在 94℃下解链 ; (2) 退火 (Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度 (50 ℃左右 ) 下与模板上的目的序列通过氢键配对 ;(3) 延伸(Extension): 在Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下 ,以目的 DNA为模板进行合成 . 由这三个基本步骤组成一轮循环 ,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106 倍RNA的多聚酶链式反应（ RT-PCR）是以 RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的 RNA互补的 cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。
RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶 DNA在RT-PCR中关键步骤是 RNA的逆转录， cDNA的PCR与一般 PCR条件一样由于引物的高度选择性，细胞总 RNA无需进行分级分离，即可直接用于 RNA的PCR但 RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含 DNA、蛋白质和其它杂质RNA中即使含有极微量的 DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残存的RNase极易将膜板RNA降解掉硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的 RNA制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行常用的 逆 转 录 酶 有 两 种 ， 即 禽 类 成 髓 细 胞 性 白 血 病 病 毒 （ Avianmyeloblastosis virus, AMV ）和莫洛尼鼠类白血病病毒（ Moloneymurine leukemia virus, MO-MLV）的逆转录酶（RT）。
一般情况下用Mo-MLV-RT较多，但模板 RNA 的二级结构严重影响逆转录时，可改用AMV-RT，因后者最适温度为72℃，高于Mo-MLV-RT的最适温度（37℃）， 而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构一步法扩增（one step amplification）是为了检测低丰度mRNA的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以 mRNA为模板进行反转录和其后的 PCR扩增，从而使 mRNA的PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD－NA的克隆，并有可能与 Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因 转录产物的测序在一个试管中进行三、材料（一）、仪器1. DNA扩增仪，亦称PCR仪2. 台式高速离心机3. 电泳仪、电泳槽4. Pharmacia Biotech公司的ImageMaster VDS凝胶成像仪（二）、塑料器皿Eppendorf管、Tip头（三）、其他物品1. 微量加样枪(0.5〜10 ul、5〜40 ul和40〜200各1支)2. Eppendorf管架（四）、DNA 模板含有靶序列的 DNA可以单链或双链形式加入 PCR混合液。
虽然 DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA(如基因组DNA)时，若用切点罕见的限制酶 (Sal I 或Not I)先进行消化，则扩增效果更好，闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此用质粒作反应模板时最好先将其线状化，但这也不是非常必要模板 DNA中靶序列的浓度因情况而异，而且往往非实验者所能控制尽管如此，仍值得按已知靶序列量递减(1ng、0.1ng、0.01ng等)的方式设置一组对照 反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求五）、试剂1. 10×PCR缓冲液(不含MgCl2)2. 5mmol/LdNTPs,4种dNTP每种浓度均为2.5mmol/L3. Taq DNA聚合酶(5u/ul)4. MgCl2，25mmol/L5. 5×TBE电泳缓冲液6. 10g/L溴化乙锭7. 1% 2%琼脂糖凝胶(浓度视待扩增的DNA片段大小而定)8. 两对套叠式引物四、操作步骤(一)、以DNA为模板的 PCR扩增反应1. 按以下次序，将各成分在0.2ml Eppendorf管中混合：1) 模板DNA(100mg/L) 5.0ul2) 10×PCR缓冲液 5.0ul3) 2.5mmol/LdNTP 4.0 ul4) 引物(5’端,30pmol/L) 1.0ul5) 引物(3’端,30pmol/L) 1.0ul6) MgCl (25mmol/L) 3.0ul27) Taq 酶(5u/ul) 0.3ul。
8) 用灭菌双蒸馏水补足体积至 50 ul2. 将溶液混匀，15 000r/min 离心 10 秒钟3. 用 50 ul 轻矿物油覆盖于反应混合液上，防止样品在重复加热－ 冷却过程中蒸发(这步可省略)4. 按以下方法进行扩增典型的变性、退火和延伸条件如下：循环首轮循环后续循环末轮循环变性94℃5 min94℃1min94℃1min退火55℃1min55℃1min55℃1min延伸72℃1min72℃1min72℃7min5. 末轮循环后不再变性，15 000r/min 离心 2min，将反应物转入另 一小管中，置-20℃保存6. 从反应混合液中取出扩增产物 DNA 进行凝胶电泳、Southern 杂交 或 DNA 序列测定分析二）、以 mRNA 为模板的 PCR 扩增反应1. 设置合成 cDNA 第一链的反应：1) 4×扩增缓冲液 2.0ul2) 2.5mmol/LdNTP 2.0ul3) Oligo(dT)12-18(100mg/L) 0.5ul4) RNAinhibitor 20U5) mRNA 1ul6) 25mmol/L MgCl22ul7) 加水至终体积 20ul*可用 10-50pmol 随机引物代替 Oligo(dT)作为引物。
2. 将溶液混匀，以 15 000r/min 离心 10 秒钟，将反应混合液置 65℃ 变性 5 min，使 mRNA 均变为单链3. 将 100-200 单位 MMLV 反转录酶加入混合物中，混匀，将反应混合 物置 37℃温育 30min4. 将温育后产物 cDNA 取出一部分按照以 DNA 为模板的 PCR 扩增反应 步骤进行预定循环数的扩增反应五、注意事项1. PCR 引物摩尔数的计算在 PCR 反应中，引物的量是以 pmol 数表示的，而合成引物后，引物的量是以 OD 值表示的因此，需经适当换算，才能配置适当浓度的引物溶液换算公式如下： 1) OD 值为 1 的引物约为 33ug2) 引物的分子量=碱基数×3303) 引物 pmol 数=OD 值×33×1000 000= OD 值×1000 004) 碱基数×330碱基数×3302. 结果假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA 聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及 PCR 系统欠妥当；循环次数不够所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入 Taq DNA聚合酶、增加 5-10 次循环，一般都会获得成功。
如果没有成功应检查 PCR 扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题为了防止假阴性的出现在选用 Taq DNA 聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶同时在提取 PCR 模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在尽管 Taq DNA 聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染PCR 扩增的先决条件及特异性是引物与靶 DNA 良好的互补，尤其是要绝对保证引物的 3′端与靶基因的互补对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR 或 double PCR在进行 PCR 操作时应注意 Mg2+ 的浓度要合理PCR 反应的各温度点的设置要合理3. 结果假阳性：PCR 结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的因为 PCR 技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是 PCR 假阳性的主要根源PCR 的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次 性吸头。