2卵母细胞成熟 21．3卵母细胞减数分裂恢复 42 c型利钠肽的研究进展 ．52．1 CNP生物学特征和功能 ．52．2 CNP的受体及其信号通路 ．62．3 CNP在哺乳动物卵巢中的表达及功能 ．73研究目的和意义 9第二部分实验部分 10第一章CNP及其受体NPR2在水牛卵巢和COCs表达模式分析 ．11 1材料与方法 ．111．1试验材料 ．．111．2试验方法 ．．141．3试验设计 ．．171．4统计分析 172试验结果 ．172．1 ANP、BNP、CNP及其受体的mRNA在卵巢中的表达 172．2 CNP及受体NPR2在水牛卵泡发育过程中的表达规律 182．3 CNP及受体NPR2的mRNA在颗粒细胞和卵丘细胞中的表达情况 202．4 CNP及受体NPR2蛋白在COCs的表达规律 ．223分析与讨论 ．234小结 ．25第二章CNP对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究 ．．26 1材料与方法 ．271．1试验材料 ．．271．2试验方法 281．3试验设计 ．．301．4统计分析 312试验结果 ．312．1 CNP对水牛卵母细胞体外成熟率及随后早期胚胎发育的影响 ．．312．2 CNP处理不同时间对水牛卵母细胞成熟率及随后早期胚胎发育的影响 ．．332．3 CNP对水牛裸卵体外成熟与随后早期胚胎发育的影响 ．．342．4 CNP对水牛卵母细胞生发泡破裂的影响 352．5 CNP对水牛卵丘细胞中Cx43、Cx37的mRNA表达水平影响 362．6 CNP对水牛COCs上卵丘细胞和卵母细胞中cAMP、cGMP浓度的影响 372．7 CNP对水牛COCs卵丘细胞中NPR2和卵母细胞中PDE3A的mRNA表达影响 38V万方数据3分析和讨论 ．404小结 ．43全文结论 ．44参考文献 ．45j改{射 ．．52攻读学位期间发表论文情况 ．53Ⅸ万方数据中英文缩略词表AbbreviationsX万方数据{广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂1灰复的影响及其机制研究第一部分文献综述1万方数据广西大掌硕士学位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分．裂恢复的影响及其机制研究1 卵母细胞体外成熟过程中的减数分裂1．1卵子发生的过程 哺乳动物卵子大多呈球形，主要由含卵黄质的细胞质和含1~2个核仁的细胞核形成，细胞核又称核卵泡或生发泡(germinal vesicle，GV)。
卵母细胞减数分裂启动时 细胞核破裂，所以排出的卵子一般不表现卵核形态【1】卵细胞膜外围由透明带(zonapellucide，ZP)包裹，ZP和膜之间的空隙称为卵周隙，ZP周围是紧密相连的卵泡细 胞随着卵泡的生长发育，卵泡细胞间出现腔隙，卵泡逐渐成熟，腔隙逐渐增大卵 泡细胞分成两部分，围绕在卵母细胞周围的卵泡细胞为卵丘细胞，卵丘细胞伸出突起， 穿过透明带与卵膜发生联系，卵丘细胞外的卵泡细胞为颗粒细胞【z，3】原始生殖细胞(PGCs)起源于早期胚胎的卵黄囊中的囊胚内细胞团，一经形成， 就通过阿米巴运动从卵黄囊上皮经肠系膜迁移到生殖脊，形成原始的卵巢卵巢中的 PGCs经过一系列生长、分化成为卵原细胞，这些细胞进行有规律的有丝分裂，不断 增生，而后进入减数分裂阶段，成为初级卵母细胞初级卵母细胞依次经过细线期、 偶线期、粗线期，然后静止在双线期，此时又被称为核网期【t】随着初级卵母细胞体 积不断增大，发生了父源性与母源性DNA的遗传重组高尔基复合体靠近细胞核， 环绕中心小体细胞质中的线粒体数目增加，并沿着核膜外表面分布，与微管连接 这些细胞器的重新组装和移动是卵母细胞代谢所必需的，这一系列重组之后初级卵母 细胞保持静止状态，即排卵前的M I前期停滞，直到卵泡发育启动【2】。
初情期后，卵 母细胞发继续发育，待卵泡细胞生长到多层时，感知促性腺激素刺激，卵母细胞减数 分裂重新启动优势卵泡中的卵母细胞继续生长，排出第一极体，发育成次级卵母细 胞，并从卵泡中排出次级卵母细胞继续进行第二次减数分裂，并经历第二次停滞期， 即排卵后的M II期停滞直到精子或者其他因素激活卵母细胞产生并释放第二极体， 完成第二次减数分裂此时，细胞核DNA复制一次，连续分裂两次，配子的染色体 数目减半，形成单倍体[5]若MII期的卵母细胞不能及时受精或激活，就会发生老 化老化卵母细胞会表现出多种形态结构的改变与功能状态的下降，严重影响卵母细 胞受精以及后期胚胎的发育1．2卵母细胞成熟 哺乳动物出生后，处于双线期的卵母细胞很快被一层扁平的上皮细胞包围，形成原始卵泡随着性成熟，原始卵泡数目迅速减少，原始卵泡发育成初级卵泡[6】由于万方数据广西大学硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其审啸I研究 卵泡腔尚未形成，初级卵泡又被称为腔前卵泡，它们的上皮细胞形态为多层的立方或柱状上皮，透明带开始形成有研究证实此时的卵泡膜细胞开始表达LH受体，卵泡 细胞表达FSH受体，卵泡能感知促性腺激素的刺激并作出反应，这对能顺利发育到 次级卵泡有重要意义【7】。
初级卵泡继续生长，卵泡内开始出现卵泡腔，形成次级卵泡， 又称为有腔卵泡此时的卵泡生长迅速，逐渐恢复减数分裂的能力【8，9】次级卵泡体 积不断扩大，卵泡液增多，卵泡壁变薄，卵泡突出在卵巢表面，成为成熟卵泡，又称 Graafiall卵泡排卵时，卵丘细胞和卵母细胞一起悬浮在卵泡液中，以卵丘．卵母细胞 复合体的形式排出值得注意的是，不是所有的初级卵泡或次级卵泡都能发育成为优 势卵泡，大部分卵泡在发育过程中就发生退化，只有极少部分卵泡能发育成熟并顺利 排卵，这可能与对促性腺激素的反应有关[10】卵泡细胞对卵母细胞的生长发育至关重 要，卵丘细胞与卵母细胞间、卵丘细胞与卵丘细胞间、卵丘细胞与颗粒细胞间不断进 行着细胞通讯，称为缝隙连接作用，使得颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞紧密结合成 一个整体[3】o已有许多研究证明哺乳动物卵母细胞在体外能自发成熟1935年，Pincus[61等成 功记录到自发成熟的兔卵母细胞从生发泡期发育到M II期Menkin和Rock[1l】在1938 年到1944年间，从800位病人体内取出卵母细胞用血清培养24h也能观察到卵母细 胞排出第一极体虽然这些早期的研究存在一定的猜测性并且没有排除内源性促性腺 激素的干扰，但是并不妨碍他们建立了卵母细胞体外自发成熟的概念。
自此，人们一 直将第一极体的排出作为卵母细胞成熟的标志随着体外受精技术的出现，人们发现 许多卵母细胞虽然排出第一极体，并且完成了减数分裂，但它们并不具备后续早期胚 胎发育的能力所以，第一极体的排出率不能衡量卵母细胞质的成熟，它仅仅代表了 细胞核的成熟在卵母细胞成熟过程中，细胞质中的细胞器发生了一系列变化，基本 规律为，随着卵母细胞成熟，细胞器逐渐向皮质区移动，成熟后，除了皮质颗粒外， 其他细胞器又移向卵子中央成熟前的线粒体主要分布在核周围，有时与核外膜相连， 呈圆形，继而数目不断增多，进入皮质区，变成带帽线粒体，成熟后，均匀分布在胞 质中【屹，”】早期的哺乳动物卵母细胞中存在很多粗面内质网，并附着有少量的核蛋白， 到卵母细胞体积最大时，粗面内质网也最发达，随后粗面内质网数目减少，滑面内质 网增多[14．17】在初级卵母细胞中，高尔基复合体分布在细胞核周围，之后向皮质区移 动，卵母细胞成熟后消失皮质区处于细胞质表层，其物理特性与其它细胞质成分不3万方数据广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究同，是一种特殊的凝胶形状在卵母细胞皮质区内有一种特殊颗粒，称为皮质颗粒， 其内含物呈同质，为粘多糖物质，可与凝集素结合，呈PAS阳性反应。
成熟时，皮 质颗粒增多，逐渐向皮质区迁移，于排卵前呈单层分布于质膜下，这已成为判断细胞 质成熟的重要指标[17_19】1．3卵母细胞减数分裂恢复 从卵母细胞的减数分裂过程中，出现了两次停滞状态第一次停滞是前期停滞期，发生在第一次减数分裂前期的核网期，又称生发泡期，从卵巢表面卵泡中抽出的卵母 细胞大多处于GV期超越前期停滞期，需要发生生发泡破裂(germinal vesiclebreakdown，GVBD)，完成向M I的转变卵母细胞继续发育，将第二次停滞在M II期，即MII期停滞卵母细胞将在MII期维持比较长一段时间，直到精子或者其他 因子的刺激，卵母细胞才会突破MII期停滞获得继续发育的能力体外培养发现，只有一部分细胞能恢复减数分裂，发育到M I影响减数分裂的 因素主要有：MPF，促性腺激素，cAMP，细胞生长因子等MPF由催化亚基P34cdc2 和调节亚基cyclin B组成，通过这两个亚基的变化来调节MPF的活性发生减数分 裂时，不同物种的MPF活性不同爪蟾中，MPF在GVBD时活性最强，进入第一次 减数分裂中后期后下降，到M II期时又升高到最强，并维持在这一时期[20-22】。
小鼠、 猪、牛中，MPF在GV期活性最弱，进入M I时升高到最强，随后又迅速降低，到 M II期时再次升高到最强，并维持在这一时期【20，23，24】研究表明，孕酮可刺激哺乳动 物卵母细胞恢复减数分裂，它是通过刺激cyclin的合成产生作用的Cdc2激酶刺激 cdc2上的Thrl 6 1发生磷酸化，从而激活了cdc2，cdc2与cyclin B迅速形成cdc2．cyclin B复合体而激酶weel和mytl刺激cdc2上的Thrl4、Tyrl5发生磷酸化，使cdc2．cyclin B复合体失去活性，即处于pre．MPF状态【25]当pre．MPF积累到一定水平是，反过来 抑制激酶weel和mytl的活性，激活磷酸化酶cdc25，去磷酸化Thrl4和Tyrl5，活 化pre．MPF，pre．MPF变为有活性的MPF，进而刺激GVBD，恢复减数分裂[25-27]促 性腺激素主要通过两种途径诱导减数分裂恢复，其一是刺激卵泡细胞产生孕酮，激活 MPF；其二是刺激卵丘细胞，中断它与卵母细胞之间的通讯，使cAMP无法顺利进入 卵母细胞，cAMP浓度下降后，重新启动卵母细胞减数分裂【28，29]。
大量的卵母细胞的 体外培养实验证明，cAMP及其类似物dbcAMP，腺苷酸环化酶及能激活它的物质， 磷酸二酯酶抑制剂等，都能抑制GVBD的发生[30_33】之后，研究者们又发现一旦激4万方数据广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究活了MPF，减数分裂的恢复就不受cAMP浓度的影响，推测cAMP是MPF的催化亚 基P34cdc2的翻译后调控因子，可以抑制它的磷酸化当卵母细胞中的cAMP浓度降 低时，它的依赖性蛋白激酶活性被抑制，细胞内的去磷酸化作用和磷酸化作用水平发 生改变，酪氨酸磷酸酶被激活，催化P34cdc2发生去磷酸化作用，被激活的催化亚基 P34酣c2使核纤层蛋白和一些RNA聚合酶发生磷酸化，从而在转录和翻译水平上调控 减数分裂，使减数分裂恢复[34】IGF、EGF、TGF等生长因子大多是在其他因素作用 下，通过卵丘细胞介导，重新启动卵母细胞减数分裂，提高卵母细胞质量和后续发育 能力[35_37】2 C型利钠肽的研究进展2．1 CNP生物学特征和功能利钠肽家族(natriuretic peptide，NP)是近20年才被人们发现的肽类物质。
1981 年，de Bold等【38】在大鼠心房中提取到A型利钠肽(atrial natfiuretic peptide，ANP)， 很快有研究者证明ANP发挥了利尿和排钠的作用f39】随后，脑钠肽(brain natriureticpeptide，BNP)、C型利钠肽、D型利钠肽(dendroaspis natriuretic peptide，DNP)、室 性利钠肽(ventricular natriuretic peptide，VNP)、M型利钠肽(micrurus natriuretic peptide，MNP)等[40-42]相继被发现其中ANP、BNP、CNP广泛存在于哺乳动物的 各组织中，而DNP、VNP、MVP尚未在哺乳动物体内被发现利钠肽家族各成员都 具有相似的内显子和外显子，这意味着它们具有共同的祖先它们具有很多相似的功 能，如利尿、排钠、调节神经内分泌、促进骨骼生长、抗纤维化、舒张血管、抗炎等【3-45】对利钠肽的深入研究使人们意识到它们的浓度可以作为某些疾病诊断的指标， 同时人工合成利钠肽可以有效治疗许多疾病【46】细胞中的利钠肽前体改变空间构象 后，形成具有生物活性的利钠肽。
利钠肽的前体都由单独的基因编码，但是在具有生 物活性的利钠肽中，都具有一个相同的环状结构，是由二硫键联结2个半胱氨酸残基 形成的17个氨基酸，这个环状结构是利钠肽发挥作用的必需空间结构最早在1990年，Sodoh在猪脑中分离提纯出C型利钠肽[41]这是由一种含有22 个氨基酸的前体衍生而来的，具有利钠肽家族共同的环状结构，但是与ANP、BNP 相比较，CNP缺乏羧基末端的延伸链研究者发现，CNP在雄性和雌性生殖过程中 发挥重要作用Middendorff的研究表明，CNP在小鼠睾丸间质细胞呈现强表达，提万方数据广西大掌硕士学位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究示CNP能调节睾丸的生精功能147]后来有研究者在体外分离培养的睾丸支持细胞中 加入了CNP，发现它抑制了支持细胞间的作用，表明CNP能以旁分泌的形式调节精 子发生和睾丸的血液供给【48]Huang也发现CNP刺激睾丸支持细胞中转铁蛋白、雄 性激素结合蛋白、抑制素B的mRNA表达，而这三者在生精过程中起着正负反馈作 用，说明CNP影响了雄性动物生精过程【49】在哺乳动物精囊、附睾、前列腺中，CNP 的mRNA呈现高表达，远远高于其他组织【50】，精浆中的CNP主要来源于此，表明 CNP极有可能参与了精子的成熟。
C11rism趾等发现精浆中的CNP浓度高于血浆、猪 脑数百倍，有可能参与精液相关功能【51】在雌性动物中，CNP在卵巢和子宫上强表 达[52】，进一步研究发现CNP参与调控卵泡发育，促进初级卵泡向有腔卵泡的转化[53] Kawamura等证实了LH峰出现后，小鼠卵泡中CNP表达迅速下降[54】，而另有学者发 现LH就是通过下调卵泡液中CNP活性来诱发排卵【55】现普遍认为CNP对胚胎发育 和胚胎着床有重要作用，可以抑制子宫收缩，松弛子宫平滑肌【56]妊娠小鼠子宫CNP表达显高于未孕小引57】，绵羊孕期中胎盘的CNP表达呈现逐渐上升趋势，且远远高于子宫和卵巢[58】，并且还能检测表达在胚胎头部和胚胎干上【59】，提示CNP对胚胎发 育有着一定联系综上所述，CNP是与哺乳动物雌、雄生殖功能相关的调节因子，但 作用机制并不清楚，值得深入探究2．2 CNP的受体及其信号通路 现有研究表明，利钠肽家族的特异性受体有三种，即NPRl、NPR2、NPR3，它们都是跨膜结构，还有一个与利钠肽特异结合的配体结合域其中，NPRl和NPR2 比NPR3多了一个鸟苷酸环化酶结构域，它能催化GTP形成cGMP，在利钠肽信号通 路上发挥重要作用。
NPR3并无鸟苷酸环化酶活性，而是与利钠肽清除有关的受体[60】 它们与C型利钠肽的亲和程度依次为NPI也>NPRl>NPR3，这表明NPR2是CNP的 特异性受体现己被认可的小鼠中经典CNP／NPR2信号通路主要组成包括：CNP、 NPR2、cGMP等当CNP结合受体NPR2，改变受体激酶同型区域(kinase homologydomain，KHD)的构象，鸟苷酸环化酶活性被激活，越来越多的GTP转化为cGMP，下游通路被激活，cGMP能够与3种蛋白结合从而激活下游生理反应，分别为cGMP 依赖蛋白激酶G、PDE、环核苷门控离子通道蛋白【6l-64]6万方数据广西大掌硕士学位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂1灰复的影响及其机制研究2．3 CNP在哺乳动物卵巢中的表达及功能2．3．1 CNP在哺乳动物卵巢中的表达 利钠肽成员中，最先被发现在卵巢上表达的是ANP，并且证实了ANP对促性腺激素的合成起到了调节作用[65，66】，人们逐渐意识到利钠肽对雌性生殖功能发挥作用 自此，研究者们开始分析CNP和NPR2在不同哺乳动物卵巢的表达模式Stepan等【67】 对未交配小鼠各组织中CNP的表达进行了定量分析，发现卵巢中CNP的mRNA表 达量是其他组织的数十甚至上百倍，甚至超过了肾脏和大脑。
Reis等【68]研究发现， CNP及其受体NPR2的蛋白和mRNA在大鼠卵巢表达，并且受到动情周期的调控， 在发情前期表达最高以上研究揭示，CNP及其受体在哺乳动物卵巢强表达，可能受 到激素调节Noubani等【69】运用原位杂交技术定位了大鼠卵巢中CNP和NPR2，结果 在卵泡间质细胞和膜细胞上发现CNP的阳性表达，在颗粒细胞上发现NPR2阳性表 达Cheng等【53】发现随着卵泡的发育，卵泡中CNP和NPR2的mRNA表达显著增强， CNP蛋白水平也逐渐增加Zhang等【70】通过qRT-PCR和原位杂交的方法研究了CNP和NPR2在小鼠卵母细胞和卵泡细胞中的定位与表达，发现CNP和NPR2的mRNA 在卵母细胞上没有表达，卵泡细胞中的壁层颗粒细胞主要表达CNP的mRNA，而卵 母细胞外围的卵丘细胞主要表达NPR2的mRNA，这对研究CNP及NPR2受体信号 通路奠定了基础随后人们围绕CNP及其受体NPR2在大动物卵巢上的表达进行了 大量研究，其结果与小鼠类似为研究CNP及其受体NPR2在卵巢中的表达调控，Jankowski等【71】分析了发情周 期各阶段卵巢中CNP及其受体NPR2的mRNA表达情况，发现发情前期的CNP及其 受体NPR2的mRNA表达量高于其他时期，推测激素能调控CNP及NPR2的表达。
为证实这一观点，Noubani等【69】对大鼠注射了外源马绒毛膜促性腺激素和雌激素，分 析它们对卵泡细胞中CNP及NPR2的表达的影响，结果表明外源马绒毛膜促性腺激 素和雌激素提高了受体NPR2在卵泡细胞的表达，但对CNP的表达没显著影响这 一结果虽然有一定意义，但是他们并未分离不同类型的卵泡细胞，即将颗粒细胞和卵 丘细胞分离出来而Zhang等【70】在体外培养液中添加FSH和雌激素处理小鼠COCs，发现FSH对卵丘细胞中NPR2的表达没有显著影响，而雌激素则提高了卵丘细胞中 NPR2的表达；注射外源马绒毛膜促性腺激素也能提高卵丘细胞中NPR2的表达Lee 等【72】发现单独添加FSH对颗粒细胞中CNP的mRNA表达没有影响，注射雌激素的同万方数据广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究时添加FSH，CNP的表达显著高于单独注射雌激素以上结果表明，FSH作用于雌 激素间接调节CNP及其受体NPR2的mRNA表达另有一些研究表明LH也参与了 CNP及其受体NPR2在卵巢中的表达调控Wang等【73】发现添加LH能激活EGF受体 信号通路，下调体外培养的卵丘．卵母复合体中NPR2的mRNA表达。
2．3．2 CNP对卵母细胞减数分裂恢复的作用 卵母细胞成熟质量是保证体外胚胎生产效率的前提，而在哺乳动物胚胎体外生产工作中，人们发现卵母细胞一旦脱离了卵泡液环境，没有了促性腺激素的刺激，细胞 核会迅速自发地启动减数分裂，提前完成成熟但细胞质发育并未成熟，各细胞器尚 未具备完全成熟的能力虽然卵母细胞排出第一极体，发育到M II期，但受精后很难 得到囊胚甚至无法卵裂这反映了卵母细胞核质发育同步、协调成熟的重要性为 了更好的模拟体内环境，促进卵母细胞质积累足够的蛋白质和母源mRNA，研究者们 开发了更为科学的体外两步成熟法顾名思义，就是将体外成熟分为两步，第一步在 培养液中添加减数分裂抑制剂成熟培养一段时间，然后再放入没有减数分裂抑制剂的 培养液中进行常规成熟目前，许多研究者采用两步成熟法探讨不同的减数分裂抑制 剂对卵母细胞发育能力的影响，结果却并不一致Miyano等[74】、Vanhoutte等【75】、 Thomas等【76】分别选取抑制剂PDE3A、丁内酯I、次黄嘌呤处理人、绵羊、牛的卵母 细胞，发现均能提高早期胚胎发育能力而Adona等[77】采用Roscovitine，Dode等[78】 采用6．二甲氨基嘌呤却抑制了早期胚胎的发育。
以上不同结果可能是因为不同的减数 分裂抑制剂作用机理的差异导致的，而且他们使用的都是化学抑制剂，对卵母细胞结 构都有不同程度的破坏，不利于胚胎发育近几年，学者们都在寻找能代替化学抑制剂的生理性减数分裂抑制剂Zhang等【70】的研究引起了人们的注意，他们发现CNP作为活性肽可以通过CNP／NPR2信号通 路，提高小鼠卵母细胞中第二信使cGMP与cAMP含量，从而抑制减数分裂的恢复， 提高卵母细胞发育能力他们还发现CNP对裸卵中cGMP与cAMP含量没有影响， 推测CNP是通过卵丘卵母细胞间的通讯发挥作用Kawamura等【46]研究也表明CNP 提高小鼠卵母细胞中第二信使cGMP与cAMP含量，抑制减数分裂的重新启动，而且 LH／hGC能下调CNP在颗粒细胞的表达，恢复减数分裂Hiradate等[79】在猪体外培养 液中添加CNP处理COCs和裸卵，发现COCs中的卵母细胞减数分裂被抑制，而裸 卵则没有Kiyosu等【80】研究报道CNP突变不影响小鼠的交配和排卵，但是卵丘细胞8万方数据广西大掌硕士学位论文 C型利钠肽对水等唧母细胞减数分裂恢复的影响及其机制司院扩展不充分，卵母细胞中碎片增多、胞质严重发黑退化，受精后发育在2细胞阶段停 滞不前。
Tsuji等[8l】发现，NPR2突变小鼠的卵母细胞激活EGF受体信号通路，提前启动了减数分裂贾振伟[82】对黄牛的研究表明，CNP处理COCs 6h后常规成熟培养，提高了卵母细胞质质量，促进了体外胚胎发育以上结果表明，CNP能抑制小鼠、猪、 牛、羊的减数分裂恢复，在小鼠体内是通过提高小鼠卵母细胞中cGMP／cAMP浓度发 挥作用，而在其他大动物中的作用机制尚未清楚，值得进行深入探讨3研究目的和意义影响哺乳动物成熟过程中卵母细胞减数分裂恢复的因素有很多，MPF、促性腺激 素、细胞生长因子、cAMP等目前对减数分裂恢复研究离不开对这些因素的调控， 而CNP作为一种生理活性物质，己被众多学者研究证实具有延缓减数分裂恢复的作 用本研究首先探讨CNP及其受体NPR2在卵泡和COCs中的表达规律，进而研究 CNP对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制，以期达到完善水牛卵母细胞成熟 培养体系，提高水牛卵母细胞成熟质量的目的，为进一步提高水牛卵母细胞体外成熟 效率和胚胎生产效率奠定基础万方数据广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究第二部分实验部分10万方数据广西大学硕士掌位论文 C型利钠肽时水牛卵母细胞减数分裂1灰复的影响及其机制习院第一章CNP及其受体NPR2在水牛卵巢和COCs表达模式分析-￡_￡_-】一刖吾利钠肽家族主要成员及受体广泛表达在哺乳动物各组织中，如大脑、心脏、 肾脏、血管等，具有利尿、排钠、调节神经内分泌、促进骨骼生长、抗纤维化、舒张 血管、抗炎等功能。
利钠肽家族成员都具有一个相同的环状结构，是由二硫键联结2 个半胱氨酸残基形成的17个氨基酸，这个环状结构是利钠肽发挥作用的必需空间结 构CNP是第三个被发现的利钠肽家族成员，近年来，许多研究表明CNP及其受体 NPR2在哺乳动物的卵巢中呈现高表达，并且随着卵巢的发育表达逐渐增强，揭示它 们可能在雌性哺乳动物生殖过程中发挥了十分重要的作用CNP是维持体内卵母细胞 减数分裂阻滞的重要物质，也有一些研究表明CNP具有促进卵泡发育的作用目前， 有关CNP的研究主要是基于以小鼠、大鼠、猪、羊为材料展开的，鲜少有对水牛中 CNP的报道本研究主要运用qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光技术，分析了CNP及 其特异性受体NPR2在水牛卵巢和COCs的表达模式，为进一步研究CNP对水牛卵 母细胞发育的影响提供生物学依据l材料与方法1．1试验材料1．1．1水牛卵巢 水牛卵巢均来自南宁市某定点屠宰场将卵巢放入盛有37C生理盐水的保温瓶里，于3h之内送至实验室，先用75％7,醇消毒卵巢30s，再用生理盐水洗净 1．1．2主要试剂CNP Antibody(H一115)、NPR-2 Antibody(H一80)购自Santa Cruz公司；TrizolReagent购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex TaqTM II、DNA Marker购自TaKaRa公 司；二甲基亚砜(DMSO)、多聚甲醛(PFA)购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购 自Hyclone公司；苏木素染液购自北京索来宝公司；辣根过氧化物酶(DAB)显色试 剂盒、3．氨丙基．3．乙氧基甲硅烷(APES)购自北京中杉金桥公司；链蛋白酶亲和素万方数据广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究标记HRP购自BIOST公司等。
1．1．3主要实验仪器普通冰箱购自海尔公司；组织自动脱水机购自湖北孝感市亚光生物公司；Leica RM2235手动轮转式切片机购自德国Leica；恒温水浴锅购自LAUDAAqualine公司；电子分析天平购自METTER TOLEDO公司；倒置显微镜购自Leica公司；实体显微镜、荧光显微镜购自日本Nikon公司；超净工作台购自苏州佳德净化科技公司；Milli．Q 超纯水机购自德国Millipore公司；制冰机购自SANYO公司；PCR仪、凝胶成像 系统、水平电泳仪购自BIO—RAD公司；恒温箱、高速冷冻离心机购自德国Thermo 公司；荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司等1．1．4主要溶液配制方法1．1．4．1免疫组织化学试剂配制(1)生理盐水：4 g KCl，180 g NaCl，2 g MgCl／，4 g CaCl2，溶于三蒸水定容至20 L (2)PBS缓冲溶液：0．6 g KH2P04，4．32 g NaHP04，0．6 g KCl，24 g NaCl，溶于三 蒸水定容至3 L，调PH至7．2～7．4，用O．22岬过滤器除菌，4℃冰箱保存3)4％PFA：12 gPFA，溶于300 mLPBS，60℃水浴助溶12 h，调PH至7．2～7．4。
4)PBS．TWeen20：1 mL TWeen20，溶于1 L PBS (5)APES溶液：2 mLAPES，溶于98 mL丙酮，现配现用 (6)3％H202：10 mL 30％H202，甲醇90 mL，现配现用7)柠檬酸钠缓冲溶液：A液：21．01 g柠檬酸，双蒸水定容至1 LB液：29．41 g柠檬酸钠，双蒸水定容至1 LA液18 mL，B液82 mL，双蒸水定容至1 L，调PH至6．0左右8)1％Triton X．100溶液：14．1 mL 30％Triton X．100，36．4 mL PBS，37℃水浴助溶2 h9)5％BSA：0．2 g BSA，溶于4 mL PBS．TWeen20，现配现用 (10)抗体：按实验设计浓度用PBS稀释，4℃冰箱保存 (11)HRP标记的链蛋白霉亲和素：按1：200比例稀释，现配现用 (12)DAB显色液：1 mL 1×HRP缓冲液1 mL，50此20x试剂A，50 laL20x试剂B，现配现用13)分色液：1 mL浓HCl，100 mL 75％乙醇，现配现用12万方数据广西大学硕士掌位说吁≮ C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究1．1．4．2细胞免疫荧光试剂配制(1)T-BSA．PBS(TBP)：O．3 g BSA，10 v．L Triton X一100，PBS定容至100 mL，调pH至7．2～7．4，4℃冰箱保存。
2)阻断液：0．3 g BSA，0．7507 g甘氨酸，PBS定容至100 mL，调pH至7．2～7．4，4℃冰箱保存3)1％BSA：1 g BSA，PBS定容至100 mL，调pH至7．2—7．4，4℃冰箱保存4)Hoechst33342：10斗g／ml，即1 ug溶于100此三蒸水1．1．5引物合成参照GenBank中己公布的原牛ANP、BNP、CNP、NPRl、NPR2、18S rRNA的mRNA序列，用premier5．0软件设计6对引物引物序列信息见表1．1，引物均由上 海生工生物工程股份合成表1．1引物序列信息Table 1-1 Primer sequences information万方数据广西大掌硕士掌位论文 C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究1．2试验方法1．2．1水牛颗粒细胞收集 参考高亚可[83】的方法，用生理盐水洗净卵巢，然后用带有12号针头的10 mL注射器将卵泡液抽出；将卵泡液收集到离心管，37℃恒温箱沉淀杂质5 min；移取上层 液体到新的离心管，500 rpm离心5 mira移取上层液体到新的离心管，1200 rpm离 心5 min；弃去上清，加1 mL PBS，吹打混匀，1200 rpm离心5 min；弃上清，加入l mL Trizol，吹打混匀，全部液体转入1．5 mL EP管，．80℃保存。
1．2．2水牛卵丘细胞收集用拣卵针将从卵巢卵泡中抽出的COCs拣到玻璃小皿内，将卵丘细胞吹打下来， 拣出其中卵母细胞用于裸卵培养，而将其余液体收集到1．5 mL EP管，1200 rpm离心 5 min；弃上清，加1 mL PBS，吹打混匀，1200 rpm离心5 min；弃上清，加入1 mL Trizol，吹打混匀，．80℃保存1．2．3 RNA提取及反转录 参照李润论文[84】，将卵巢组织剪成黄豆大小，立即放入液氮中速冻，再放入研钵中进行液氮研磨，从研钵中取出组织粉末放入盛有1 mL Trizol的EP管，待温度渐渐 升高后盖上盖子快速混匀充分裂解将之前收集到的颗粒细胞和卵丘细胞从．80℃冰 箱取出，共同进行以下步骤吹散组织和细胞，使其悬浮，冰上裂解5 min，使核蛋 白复合物分离；加入氯仿200 IxL，剧烈振荡15 S，冰上放置5 min，使其自然分层， 13000 rpm 4"C离心15 min；取上清到新的EP管，加入500 mL预冷的异丙醇，混匀 后冰上放置5 min，13000 rpm 4"C离心10 min；弃上清，加入1 mL 75％乙醇，混匀后 7500 rpm 4℃离心5 min；弃去乙醇，开盖晾干；加入10此左右的DEPC水溶解RNA； 用2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解，测OD后计算RNA浓度，保存于．80℃ 冰箱。
消化反应体系：RNA模板2肛g，10xDNase I buffer 1此，DNase I 1此，RNase Inhibotor O．5此，加RNase．free水补至10此反应程序：37℃30min，95℃10min 加入1此EDTA终止消化，65℃10 min，4℃保存逆转录反应体系：AMV buffer 4此，dNTP 2此，Random Primer 1此，AM。