A大肠杆菌感受态的制备（CaCl?法）（《水稻nr和nir基因启动子的克隆及功能验证》第38页）1材料、设备及试剂1.1材料大肠杆菌 DH5a、BL21、Rossette、JM109 菌株1.2试剂LB液体培养基：蛋白胨 10g/L酵母提取物 5g/LNaCl 10g/LNaOH （1mol/L） 1mL/L400mL 0.1M/L预冷的CaCl2溶液（高温高压灭菌）50%甘油75%酒精95%酒精液氮1.3实验设备接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三 角瓶 4 个，移液抢（5mL、200yL, 1000yL）,灭菌的枪头（5mL、200yL, 1000yL）,离心 管（1.5mL, 50mL）恒温摇床，灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高 速冷冻离心机2实验步骤1、 从新鲜培养的大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基 中，于37°C, 200rpm振荡培养过夜2、 培养12〜16h,取1ml培养物加入到100mL新鲜LB培液体养基中，于37C，200rpm振 荡培养至OD=O.4〜0.6（3〜4h）3、 在无菌条件下将菌液转移到250mL离心管中，置于冰上10min.4、 于4C, 3000rpm离心5〜10 min,弃上清，收集菌体。
5、 加入20mL预冷的0.1M/L CaCl2溶液重新悬沉淀，至于冰上30min （严格）6、 于4C, 3000rpm离心5〜10 min,弃上清，收集菌体7、 加入4 mL0.1M/L CaCl2溶液及15%（最终浓度）甘油（50%的甘油1.71428 mL）,重悬沉淀8、 以100gL每管分装于1.5mL冻存管中保存于液氮3试验结果 4注意事项B大肠杆菌DH5 a感受态的制备（《褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究》第9页）1、 将置于液氮（-80°C）保存的大肠杆菌在LB平板上划线，37°C培养活化2、 挑取经活化的大肠杆菌单菌落于NZY液体培养基，18°C, 200-250rpm培养3、 当OD600O.7-1.O时，用预冷的50mL离心管，4°C, 4000离心10min,收集菌体4、 用-20°C预冷的TB Buffer重悬菌体,4°C, 3000离心10min，收集菌体5、 重复步骤46、 用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO（二甲基亚砜）至浓度7%7、 冰浴10min，分装保存于液氮中备用C E・coliDH5a感受态细胞的制备及转化1目的学习掌握CaC12法制备感受爱的原理和方法学习掌握感受态细胞转化的原理和方法把前面实验的两个连接反应结果和一种商品质粒进行转化实验2原理2.1名词概念感受态细胞：处于接受外源DNA的生理状态的细胞细胞转化：从遗传学出发，转化是特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细 菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化。
细胞感染：指以噬菌体、病毒作为载体构建的重组DNA导入细胞的过程，使细胞发生可遗 传的变异，它是与细胞转化概念相对而定义的细胞致敏：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作过程2.2原理培养至对数生长期的E.coli DH5a菌在0摄氏度经过低渗CaCl2溶液致敏处理，就可成为高 效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置0摄氏度30min,混合物中的DNA形成 DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42摄氏度短时热激以促进质粒进入细胞实 现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落3材料、试剂和仪器3.1材料菌株 E.coli DH5a质粒pBS实验6的两个连接反应结果3.2试剂LB液体培养基：蛋白胨 10g/L酵母提取物 5g/LNaCl 10g/LNaOH （1mol/L） 1mL/L固体LB培养基为在液体LB培养基中加1%琼脂粉LB/Kan（50卩g/mL）固体培养皿2个LB/Amp（100卩g/mL）固体培养皿3个灭菌的 0.1mol/L CaCl2灭菌的去离子水3.3仪器用品高速制冷离心机、超净台、42°C水浴、37°C培养箱、电子天平、制冰机、pH计、量筒 （10mL,100mL,500mL,1000mL）烧杯（50mL,100mL,500mL,1000mL）、玻璃棒、镊子、微 量移液器（1000吐，200卩L）、吸头（1000吐，200卩L）、1.5mL离心管、平皿、灭菌锅及紫 外分光光度仪等。
4操作步骤以下操作步骤要注意防止杂菌污染4.10〜4C保存菌种]接种在 LB,37°C250r/min,过夜菌：LB 按 1:30~100 接种，37C250r/min,活化培养 2〜3h, OD®=0.2〜0.4600加1.5mL菌液，放置冰上10min0〜4°C, 4000r/min， 2min0〜4°C,彻底弃上清的菌体加0.1mol/L CaCl2 0.6mL，缓和悬菌，放置冰上10min4000r/min， 10min0C彻底弃上清冰冷的0.1mol/L CaCl2 0.2mL，缓和悬菌，放置冰上待用分装在4个管中冻融法制备农杆菌感受态 （《水稻nr和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第42页）①制备YER液体培养基，使Rif终浓度分别为50mg/l,混匀后于4°C保存 ②从YER平板挑取根癌农杆菌EHA105单菌落，接种于10ml YER液体培养基中，28°C, 200rpm振荡培养过夜取2ml培养液加到50ml YER液体培养基中，28°C, 200rpm振荡培养至OD=0.5〜1.0,冰 浴 30min.4、 在无菌条件下降菌液分装于40ml离心管中，于4C, 5000rpm离心5 min,弃上清，收集 菌体。
5、 用10ml冰冷的20mmol.L-1CaCl2溶液重悬菌体，于4C, 5000rpm离心5 min,弃上清， 收集菌体6、 用0.5ml冰冷的20mmol.L-iCaCl2 （含15%甘油）重悬菌体7、 以100微升每管分装到预冷的1.5ml冻存管中，-80C保存农杆菌感受态的人制备（水稻MAPKK家族基因克隆及转基因研究第17页） 根癌农杆菌感受态细胞制备（osMAPK4基因水稻突变体的培育及功能分析第16页）1、 挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml含有Sm50mg/L、Rif50mg/LYEB液体培养基中，28C, 200r/min振荡培养过夜（12小时）2、 取上述菌液按照1： 10比例接种于50ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，200r/min 振荡培养5〜6小时，至OD为0.5左右，6003、 将菌液冰浴30min4、 分装至1.5ml离心管中，5000rpm离心5 min，弃上清5、 用100微升的预冷的20mmol.L-iCaCl重悬菌体，于4C保存备用。