新药实验设计——对某新药抗癫痫的作用的大鼠药效学研究高青 胡志强 刘晓凤 安莲莲 杨怡君 摘要 目的 ：对比已知疗效的抗癫痫药物，明确新药抗癫痫发作的类型、效 果和剂量关键词：抗癫痫 药效学 急性毒性实验 LD50 量效关系背景知识我国目前有癫痫患者将近 900 万人癫痫是一类慢性、反复性、突然发作 性大脑功能失调，其特征为脑神经元突发性异常高频率放电并向周围扩散由于 异常放电神经元所在部分（病灶）和扩散范围不同，临床就表现为不同的运动、 感觉、意识和植物神经功能紊乱的症状1981 年国际抗癫痫联盟根据临床和脑电波特点制定了癫痫发作的分类，沿 用至今该分类将癫痫发作分为部分性发作、全面性发作、不能分类的癫痫发作 三类癫痫的发病机制非常复杂，迄今尚未完全阐明部分性发作分为单纯部分性发作和复杂部分性发作单纯部分性发作多为症 状性癫痫，脑器质性损害较为常见，发作时程较短，无意识障碍复杂部分性发 作占成人癫痫发作 50％以上，是由颞叶结构异常放电所致，海马和杏仁核在癫 痫的发生、发展中起重要作用全面性发作的特征是发作时伴有意识障碍或以意识障碍为首发症状大部分 全面性发作与遗传关系密切，至今已知150 种以上少见的基因缺陷综合征是以癫 痫大发作或肌痉挛发作为临床表现的。
癫痫发作不仅会对大脑造成不同程度的损伤，对患者的生活质量也会造成非 常严重的影响因此，在我国，治疗癫痫病具有非常重要的意义前言本实验研究针对癫痫的部分性发作和全面性发作，采用了两种模型对于 部分性发作，采用海仁酸建立颞叶癫痫模型，，并采用苯妥英钠做阳性对照药物 对于全面性发作，采用从日本引进的具有遗传性癫痫小发作的震颤大鼠作为实验 模型，观察新药对震颤大鼠癫痫小发作的影响同时通过向SER大鼠头面部吹风刺 激产生强直抽搐发作，观察新药对SER大鼠癫痫大发作的影响，并采用丙戊酸钠做 阳性对照药物从而对已经发现证实有抗癫痫作用的新药进行药效学实验本实验涉及三种观测指标癫痫发作时大脑异常放电，所以用脑电波观测癫 痫发作是最常见的办法由于癫痫常常具有运动感觉、自主神经、意识和精神 状态不同程度障碍的临床表现，故可采用行为学的观测手段，通过大鼠的 行为变化来判断癫痫发作 癫痫发作对于脑部有不同程度的损伤， Morris 水 迷宫实验通过入水后搜索藏在水面下平台所需的时间、采用的策略和它们的游泳 轨迹， 从而可分析和推断动物的学习、记忆和空间认知等方面的能力，能较客观 地衡量动物空间记忆、工作记忆以及空间辨别能力的改变，进而判断癫痫的发作 情况。
方法急性毒性试验一、LD50的测定 最小致死量是使动物刚好致死的药物剂量，但由于药物的性质，给药方法和个体 差异，每只动物的最小致死量有很大的差异，实验和统训学原理表明一群动物最 小致死量的平均值相当于半数致死量1、预试验： 取大鼠20只，动物体重大体相同（平均波动范围不超过20%），设5组，每组4 只，先用 1:10的剂量比给药（如5mg / kg、50mg / kg、500mg / kg、5000mg / kg 固定剂量），分别按组腹腔注射新药观察一段时间，观察大鼠出现的症状并记 录死亡动物数然后在死亡数4/4和0/4两组之间按1:2（如50mg/kg、100mg/kg、 200mg / kg、400mg / kg）以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的引起0% 和100%死亡率剂量的所在范围，即最大剂量（Dm）和最小剂量（Dn） 2、正式试验： 2.1观察指标 皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现等症状 出现和消失的时间，死亡时间最后全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病 变情况有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏 器的病理组织学观察2.2实验操作在预试验的Dn和Dm剂量范围内按等比设5个剂量组，使组间距K在0.7-0.85范围 内，尽可能使半数组的死亡率都在50%以上，另半数组的死亡率都在50%以下， 各组动物只数应相等，每组10只以上，雌雄各半，动物按区组随机法均匀分配， 分别编号。
给药前应禁食（不禁水）过夜各给药组和溶剂对照组按体重腹腔注射 给药后，多次观察并及时详细记录毒性反应症状，记录受试剂量、各组死亡只数 填入表格（见附表一），在通过BL410软件采用Bliss法计算LD50和可信限若受试药物的浓度或体积限制，无法测出半数致死量（LD50）时，作最大给药 量试验试验选用拟推荐临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度 （溶液 仍有较好的流动性），最大体积的给药量1次或1日内2〜3次给予动物以小鼠口 服为例：动物数不得少于20只，雌雄各半，容量一次不超过0.4ml/10g（体重），多 次给药间隔时间不低于4h，观察7日，记录毒性反应和体重变化如仍未见毒性 反应或体重正常增加，则可认为该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或 LD50 大于最大给药量附表组号受试剂量（mg/kg）动物只 数中毒现 象中毒反 应出现 时间中毒反 应消失 时间死亡只 数死亡大 致时间2.2结果评价 对观察到的毒性反应的症状及出现的时间和消失的时间进行综合分析，对动物死 亡的原因结合病理组织学检查进行推测并做出评价量效实验备注：假设药物LD50测定结果为5.40g/kg则设定低、中、高剂量组给药量分别为27g/kg、0.54g/kg, 1.08g/k@1.1.1部分复杂性发作（慢性颞叶癫痫）模型：模型建立及分组按参考文献［2］ 制作。
立体定向下右侧海马CA3区注入4ug/kg海仁酸，于癫痫持续状态（SE） 60 分钟后腹腔注射地西泮（4mg/kg）以中止SE，降低致死率给药：选择完全点燃的 大鼠随机分为五组（每组动物10只），对应的药物为：A组阴性组（癫痫模型组） -生理盐水（10ml/kg）、B阳性组（苯妥英钠组）（0.38g/Kg）、C新药组高剂 量（1.08g/kg）、D新药组中剂量（0.54g/kg）、E新药组低剂量（0.27g/kg）；药物灌 胃自造模一周后开始，（剂量确定方法：临床成人常用维持按单位成人体重的6.25 倍［3］转换为大鼠剂量），每天上午一次共持续20天每天上午灌胃一次，持续给 药20天观察给药后大鼠的行为学变化（方法见1.2.3）,并记录给药后lh、给药 6d后lh、停药1d. 2d. 3d. 4d后的脑电图，每次均连续记录15 min（方法见1.2.4）1.1.2全身性发作模型：引进的具有遗传性癫痫小发作的震颤大鼠1.1.2.1震颤大鼠的筛选 ：剪大鼠尾尖装入微离心管中，加入尾缓冲液及蛋白酶 k，涡旋后55°C水浴过夜过夜后的样品以tris平衡酚和氯仿进行分离，提取DNA 将DNA样品加入PCR工作液进行扩增。
取扩增后的模板与载体缓冲液混合，在灌好 的琼脂糖凝胶中加样、水平电泳电泳结束后对凝胶进行图像分析，筛选出震颤 大鼠结合小发作和大发作的行为学变化将选出的震颤大鼠分为小发作模型（50 只）和大发作模型（50只）1.1.2.2小发作模型给药： 将筛选出得小发作大鼠其随机分为5组，每组10只： A 组-阴性组（癫痫模型组）-生理盐水（10ml/kg）、B组-阳性组（丙戌酸钠组） （0.036g/kg）、C组-新药组高剂量（1.08g/kg）、D组-新药组中剂量（0.54g/kg）、E 组-新药组低剂量（0.27g/kg）每天上午灌胃一次，持续给药20天观察给药后 大鼠的行为学变化（方法见1.2.3）,并记录给药后lh、给药6d后lh、停药 1d. 2d. 3d. 4d后的脑电图，每次均连续记录15 min （方法见1.2.4）1.1.2.3大发作模型给药： 将筛选出得大发作大鼠其随机分为5组，每组10只： A组-阴性组（癫痫模型组）-生理盐水（10 rnl / kg）、B组-阳性组（苯妥英钠）（（37.50mg/Kg）、C组-新药组高剂量（1.08g/kg）、D组-新药组中剂量（0.54g/kg）、E组-新药组低剂量(0.27g/kg)。
每天上午灌胃一次，持续给药20天观察给药后 大鼠的行为学变化(方法见1.2.3),并记录给药后lh、给药6d后lh、停药Id. 2d. 3d. 4d后的脑电图，每次均连续记录15 min (方法见1.2.4)1.2.1 行为学指标观察：观察比较给药后各组大鼠的肢体活动、共济协调能力与精神状态等1.2.2 脑电记录记录：电极的埋植在戊巴比妥钠(3%, 45mg/kg)腹腔麻醉下将 大鼠固定于江湾I型脑立体定位仪上，切开眼一耳间中线皮肤，刮净肌肉及骨膜， 止血、消毒参照George Paxinos and Charles Watson图谱，在右侧海马(A=5.6mm、L=4.5mm、v=4.2mm)埋植不锈钢针记录电极(直径0.3mm，尖端裸露 0.3mm，其他部位绝缘)，参考电极(与记录电极性质相同的不锈钢电极)埋置与 头皮下，接地电极插入下肢皮下，记录电极用牙托粉加502 胶水固定海马核团 脑电活动采用MD2000生物信号采集系统记录参数置为，增益：4000；滤波：100Hz； 时间常数：0.1S实验结束后用美蓝法验证电极植入的部位记录后对放电活动 进行功率谱分析功率谱分析指标与预置为：频率范围0〜100Hz，频率分辨率为 0.195Hz。
使用快速傅立叶方法计算总功率中6 ，0 ，a ，p 1，p 2五个 频段的功率百分比，各频段的频率范围是：6 : 1.17〜3.91Hz，0 : 3.91〜 8.20Hz， a ： 8.20 〜13.28Hz， p 1： 13.28 〜20.31Hz， p 2： 20.31〜30.8Hz1.2.3 Morris 水迷宫实验：术后90 天进行5 天的水迷宫实验：实验时取上述 各组大鼠，每天将大鼠面向池壁放人池中，记录2 min 内寻找到平台的时间(即 逃避潜伏期)，四个象限，取其平均值作为学习成绩大鼠在2 min 内未找到平 台，由实验者将其引至平台上并停留30s，再放回笼中，使观察周围标志物，以 达到认知目的1・2・4外周血象及肝功能检测：大鼠断头取血EDTA抗凝，用Ac.T5diff血液分 析仪测定RBC/ (X 109L-1)、Hb/ (g ・L-1)、PLT/(X 109L-1)、WBC/(X 109L-1)、 LYM/( %)、 GRAN/( %)等血常规指标；分离血清， Lx-20 全自动生化仪测定 AST/(U・ L-1)、 ALT/(U・ L-1)、 ALP/(U・ L-1)、 TP/(g・ L-11)、 ALB/(g・ L-1) 等各项肝功能常用指标。
1.3 数据及统计分析:数据结果用均数土标准差(x土 s)表示，采用SPSS12.0 forwindows软件行单因素方差分析和q检验比较各组间差异，检验水准a = 0.05， P<0.05 视为差异有统计学意义， P<0.01 视为差异存在统计学意义1.4 结果评价：对比药物药对癫痫癫痫发作、癫痫大发作、癫痫小发作大鼠 的行为学、电生理学等指标的影响，初步判断新药的最适应症状及相应的作用效 果和适宜的药物剂量讨论：急性毒性试验的目的是推测新药对人的急性毒性的强弱同时，它可以为长期毒性试验、 生殖毒性试验、致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关 毒性信息，还可以推测受 试药物毒性发生的速度和持续时间，与半数有效量（ED50）比较判断新药的安全系数因此， 急性毒性试验对了解新药的毒性是非常必要的鉴于种种因素造成急性毒性试验结果（症状 和致死量）在不同实验室内有较大的差异，且耗费大量动物而所取得的动物毒性的信息量相 对较少，因此，各国目前都在修订急性毒性试验的技术要求，希望能利用尽可能少的动物数 量而取得有价值的信息，同样达到急性毒性试验的目的半数致死量（ lethal dose 50%, LD50 ）：是指能够引起试验动物一半死亡的药物剂 量，通常用药物致死剂量的对数值表示。
LD50 及相应置信区间是由剂量 -反应模型得 出的最常用的统计量实验中观察记录大鼠在不同给药剂量下的死亡个数，再由统计 学规律求的 LD50点燃模型是一种通过重复给予一个首发阈下电或化学刺激引起部分或全面性癫痫发作 的癫痫模型，具备慢性、自发性和复发性特征，兼具诱导致痫和自发性发作模型的优点，点 燃一旦建立，动物的这种脑细胞及惊厥行为敏感性可长期维持以至终身，点燃模型是研究脑 细胞兴奋性、可塑性以及学习和记忆癫痫发病机制、癫痫外科手术预后判断的理想动物模 型海仁酸颞叶癫痫模型是国际经典的慢性颞叶癫痫模型很多研究表明，大鼠海仁酸点燃 模型已成为评价和筛选抗癫痫药的较好的模型，海马CA3区的点燃（颞叶内侧）相当于模 拟人类复杂部分性发作传统抗癫痫药物中，苯妥英钠和卡马西平被认为是治疗人类复杂部 分性癫痫发作的传统首选药脑电波的改变与癫痫联系十分密切，癫痫治疗的好转往往伴随 着脑电波的改善海仁酸制作癫痫模型可分为系统给药和局部给药, 系统给药（ 8~ 12 mg /kg 体重） 为 通过皮下、腹腔以及静脉给药, 局部给药为通过脑室或海马给药由于系统给药操作方便, 制作简单, 因此被广为利用。
海仁酸颞叶癫痫发作具有长期的癫痫敏感性首先, 海仁酸本 身的神经兴奋毒性和其引起的传导性神经兴奋毒性使海马内的兴奋-抑制平衡遭到破坏,引 发癫痫发作, 造成海马神经元的减少、缺失以及随后的胶质细胞增生其次, 在海马神经元 的减少中，齿状回中以r -氨基丁酸能神经元为主的抑制性中间神经元的减少又使海马内的 兴奋-抑制平衡进一步破坏, 这样, 海马神经元的减少和缺失便从癫痫发作的结果变成了再 次癫痫发作的原因， 如此以来， 兴奋-抑制平衡的破坏和海马神经元的减少缺失便互为因果， 形成一个有始无终的发作环路， 使癫痫发作永久存在， 使模型具有长期的癫痫敏感性因此， 海马神经元的缺失和胶质细胞的增生是癫痫敏感性永久存在的病理学基础Racine提出了癫痫大鼠行为学的分级标准，其标准为：I级，咀嚼、眨眼、立须等面部 肌肉抽搐；II级，以点头运动为主的颈部肌肉的抽搐；III级，单侧前肢的阵挛、抽搐；W级， 双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起;V级，双侧后肢强直、身体背曲强直、跌倒从发作形式 上看, 模型模拟了人类颞叶癫痫从“口唇的自动症、涎涎分泌等植物神经症状、头部的自动 症”到“单侧上肢的抽搐、双侧上肢的抽搐”, 最后扩展到“ 下肢阵挛、身体强直阵挛” 的全部发作过程, 发作形式与人类颞叶癫痫极为一致。
Morris水迷宫是研究与海马功能直接相关的空间学习记忆模型，可较准确的反映动物的 空间记忆和学习能力，研究结果表明，造模90天后大鼠学习和记忆能力明显降低抗癫痫药 对认知能力的影响具有双重性，引起对病变部位神经元的兴奋性和维持正常认知功能神经元 的兴奋性有同样的降低作用，故抗癫痫药导致的认知损害，在一定程度上靠减少发作来代偿， 所以，对癫痫的治疗作用也可能间接改善了认知参考文献：[1] 窦立敏杨天明1张世明•临床抗癫痫新药治疗的动物实验J].现代生物医学进展2007[2] 杨忠旭，栾国明，张颖.颞叶癫痫模型的建立及其相关研究[J]•中华神经外科疾病研究杂志,2005， 4(2)：149－151.YANG ZHONGXU, LUAN GUOMING, ZHA-NG YING.Establishmentof temporal epilepsymodel and its relative research [J]. Chin JNe-urosurg Dis Res, 2005， 4(2)：149-151.[3] 梁建民，李秀杰，崔新明，海人酸杏仁核点燃大鼠癫痫模型的建立和评价【j】吉林大学学报(医学版)Nov • 2005[4] 洪钢，章江生&,王琳辉'抗癫痫药物研究进展【j】中国临床药理学与治疗学，[5] 窦立敏，奥卡西平、拉莫三嗪、妥泰治疗复杂部分性癫痫的动物实验【j】[6] 冯艳丽，六茜素及新制剂的药理学和毒理学研究[7] 徐叔云，卞如濂，陈修《药理实验方法学》。