首 先 了 解 样 品 的 性 质一 般 性 质 ： 试 样 的 体 积 、 酶 （ 蛋 白 质 ） 和杂 质 的 量 、 试 样 的 pH及 离 子 强 度酶 的 物 化 特 性 ： 大 小 、 pI、 S(solubility)、亲 水 性 、 化 学 性 质酶 的 生 化 特 性 ： 稳 定 性 、 辅 助 因 子第 六 节 酶 纯 化 步 骤 的 设 计 考 虑 相 容 性A.开 始 阶 段样 品 体 积 、 数 量 大 首 先 考 虑 高 容 量 capacity， 其 次 高 分 辨 率 resolution处 理 量 小 时 则 反 之B.盐 析 后 盐 浓 度 高 ， 影 响 离 子 交 换 色 谱 和 电 泳 ，需 先 进 行 透 析 或 凝 胶 过 滤 脱 盐 1.分 离 方 法 的 顺 序 C 分 离 的 每 个 步 骤 选 择 不 同 性 质 的 分离 方 法D 最 后 分 离 条 件 注 重 复 原 性 、 快 速 ，因 为 蛋 白 质 越 纯 稳 定 性 下 降 越 快 2.初 步 纯 化一 般 注 意 点 ：A. 温 度B.避 免 极 端 I,pHC.有 机 溶 剂D.蛋 白 质 的 浓 度 （ 高 稳 定 ， 因 为 蛋 白 质 带负 电 ， 排 斥 力 大 ）E.避 免 泡 沫 和 膜 的 形 成F.酶 的 活 性 6.纯 化 步 骤 的 定 量 评 价3.选 择 性 的 纯 化 步 骤 色 谱 法4.检 查 纯 化 的 进 展 情 况 常 用 电 泳 （ PAGE, SDS-PAGE, IEF）5.进 一 步 纯 化 根 据 4结 果 ， 若 分 子 大 小 差 异 GEC若 电 荷 差 异 离 子 交 换 色 谱 7.在 纯 化 过 程 中 酶 活 力 的 损 失主 要 原 因 ： 蛋 白 质 变 性 避 免 方 法 ： 改 变 温 度 和 pH 其 他 原 因 ： 辅 助 因 子 被 去 除 酶 分 离 纯 化 的 方 案 设 计The following information is known about four proteins: Protein Mr pI SubunitsA 13,100 5.2 1B 14,200 9.1 1C 35,500 6.2 1D 200,000 5.8 4 identical, 50,000 each a. Sketch the elution profile expected if this mixture is run on a Sephadex G-100 gel filtration column run in 50 mM phosphate buffer, pH 6. Label the peaks.b. Sketch the gel obtained from running these proteins on an SDS polyacrylamide electrophoresis gel at pH 8.0, (after staining and destaining).c. What predictions can you make about the results of a native PAGE at pH 7.6 ( state any assumptions you might need to make about the % acrylamide in the gel ) d. Sketch the elution profile of these proteins from a carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography column, run at pH 6.25 (with a salt gradient, if necessary). Label the peaks. 第 七 节 蛋 白 质 浓 度 的 测 定 凯氏定氮法双缩脲法福林（Folin)-酚试剂法考马斯蓝染色法紫外光吸收法 Determination of enzyme activityEnzyme activity （酶活力，酶活性）Active unit（酶的活力单位）Specific activity（酶的比活力） Enzyme activity定 义指 酶 催 化 一 定 化 学 反 应 的 能 力用 在 一 定 条 件 下 ， 酶 所 催 化 的 某 一 化 学 反 应 速 度（ 初 速 度 ） 来 表 示方 法测 定 产 物 增 加 的 量 或 底 物 减 少 的 量eg. 化 学 滴 定 、 比 色 、 测 定 紫 外 吸 收 、 荧 光 测 定 Active unit （U）国 际 单 位1个 酶 活 力 单 位 ， 是 指 在 特 定 条 件 下 ， 在 1分 钟 内能 转 化 1微 摩 尔 底 物 的 酶 量 ， 或 是 转 化 底 物 中 1微摩 尔 的 有 关 基 团 的 酶 量 。
特 定 条 件 ： 温 度 25oC 其 他 条 件 （ eg. pH及 底 物 浓 度 ） 均 采用 最 适 条 件 习 惯 用 法eg. -淀 粉 酶 ， 用 每 小 时 催 化 1g可 溶 性 淀 粉 液 化所 需 要 的 酶 量 来 表 示 实例-淀粉酶，-淀粉酶果胶酶蛋白酶脂酶过氧化物酶 (POD)多酚氧化酶 (PPO)脂肪氧合酶 -淀粉酶活力测定方法碘显色能力下降的速度底物粘度下降速度糖苷键被打断的速度-淀粉酶活力的测定方法麦芽糖形成的速度3，5-二硝基水杨酸、铁氰化钾或碱性铜盐溶液测定还原基团形成的速度 果胶酶活力的测定PE (pectin esterase果胶酯酶)： 滴定法(pH-stat法)PG (polygalacturonase聚半乳糖醛酸酶)和PMG (polymethylgalacturonase聚甲基半乳糖醛酸酶)（为内切酶时）：粘度法PMGL （polymethylgalaturomide lyase聚甲基半乳糖醛酸裂解酶） PGL（ polygalacturonmide lyase聚半乳糖醛酸裂解酶）：降解产物的C 4和C5之间形成双键，在235nm处有吸收。
蛋 白 酶 活 力 的 测 定蛋 白 质 酶 肽原 理 ：根 据 蛋 白 质 经 酶 作 用 后 在 一 定 浓 度 的 三 氯 醋 酸（ TCA） 溶 液 中 溶 解 度 的 变 化 来 确 定 酶 的 活 力 肽 的 含 量 测 定 ：紫 外 分 光 光 度 法显 色 法 （ 茚 三 酮 、 双 缩 脲 试 剂 、 福 林 酚 试 剂 ） 国 标 (QB547-80)原 理 ： 蛋 白 酶 水 解 酪 蛋 白 ， 其 产 物 中 含 酚 基的 氨 基 酸 在 碱 性 条 件 下 能 被 福 林 (Folin) 试剂 还 原 ， 生 成 蓝 色 化 合 物 ， 从 蓝 色 的 深 浅测 知 酶 活 力 的 大 小 底 物 ： 0.5%酪 蛋 白缓 冲 溶 液 ： 0.02M， pH7.5PB酶 液 配 制 ： 精 确 取 定 量 的 酶 粉 100mg， 加 少 量 缓冲 液 研 磨 ， 定 容 100ml， 离 心 ， 取 上 清 液 10ml定容 100ml酶 活 力 测 定 ： 酶 和 底 物 分 别 于 30 水 浴 保 温 ，取 出 2ml底 物 加 入 稀 释 的 酶 液 1ml， 立 即 混 匀 计时 ， 反 应 15min， 立 即 加 入 3ml 10%TCA终 止 ，室 温 静 置 半 小 时 ， 过 滤 ， 取 1ml滤 液 用 Folin-phenol法 测 定 可 溶 性 蛋 白 质 ， 680nm比 色 。
中 性 蛋 白 酶 AS1398 活 力 的 测 定 酶 活 力 定 义 ： 在 30 pH7.5条 件 下 ， 每 分 钟 水解 酪 蛋 白 产 生 1g酪 氨 酸 的 酶 量 为 一 个 酶 活 力单 位 目 前 国 内 工 厂 都 以 1g酶 制 剂 所 含 的 酶 活力 单 位 数 来 表 示 酶 制 剂 的 活 力 酶 活 力 单 位 =6/15KO.Dn总 体 积反 应 时 间 标 准 曲 线 中 O.D值 为 1所 相 当 的 酪 蛋 白 微 克 数酶 液 稀 释 总 倍 数 脂 酶 活 力 的 测 定 底 物 ： 不 溶 解 的 甘 油 三 酯 （ 甘 油 三 酸 酯 、 橄 榄油 ）测 定 方 法 ：1. 当 反 应 进 行 到 一 定 的 时 间 ， 在 反 应 体 系 中 加入 溶 剂 （ 乙 醇 或 丙 酮 ） 以 终 止 反 应 ， 然 后 滴 定在 反 应 中 释 出 的 脂 肪 酸 ；2.采 用 pH-stat法 ， 在 pH8连 续 测 定 整 个 反 应 过程 中 游 离 脂 肪 酸 含 量 随 时 间 而 增 加 的 速 度 ； 3. 反 应 中 产 生 的 H+与 加 入 的 NaHCO3作用 释 出 CO2， 后 者 可 用 呼 吸 仪 测 定 ；4.测 定 脂 肪 酸 的 产 生 而 导 致 的 反 应 体 系表 面 张 力 的 下 降 ；5.采 用 生 色 底 物 ， 如 乙 酸 -萘 酯 过 氧 化 物 酶 活 力 的 测 定原 理 ： 有 氢 供 体 存 在 的 条 件 下 ， 过 氧 化物 酶 催 化 过 氧 化 氢 分 解 的 同 时 形 成 有 色化 合 物 。
方 法 ： 分 光 光 度 法 多酚氧化酶活力的测定测定底物消失的速度测定产物生成的速度 脂 肪 氧 合 酶 的 活 力 测 定量 压 法分 光 光 度 法 Specific activity比 活 力每 毫 克 蛋 白 所 具 有 的 酶 活 力单 位单 位 /毫 克 蛋 白 （ U/mg蛋 白 质 ）对 同 一 种 酶 ， 比 活 力 愈 高 ， 酶 愈 纯 分离方法总的酶活力（单位）产量或回收率（%）总的蛋白质(mg)比活力（酶单位/mg蛋白质）纯化倍数粗液萃取33652 498210%硫酸铵饱和度，上清液32200 3300Bio-Gel P-60柱25560 1474DEAE-Sephadex 柱17253 308ConA-Sepharose 柱4614 5.9Phenyl-Sepharose CL-4B柱2300 1.7DEAE-Sephadex 柱1410 0.33过 氧 化 物 酶 纯 化 表 分离方法总的酶活力（单位）产量或回收率（%）总的蛋白质(mg)比活力（酶单位/mg蛋白质）纯化倍数粗液萃取33652 100 4982 6.8 1.010%硫酸铵饱和度，上清液32200 96 3300 9.8 1.4Bio-Gel P-60柱25560 76 1474 17.3 2.5DEAE-Sephadex 柱17253 51 308 56.0 8.2ConA-Sepharose 柱4614 14 5.9 782.0 115.0Phenyl-Sepharose CL-4B柱2300 7 1.7 1352.9 199.0DEAE-Sephadex 柱1410 4 0.33 4272.7 628.4过 氧 化 物 酶 纯 化 表 蔗 糖 合 成酶的纯化表：纯化 步骤全 蛋 白质 回 收 率 全 部 活 性 比 活 性 纯化倍数 粗抽提液鱼精蛋白沉淀后上清 硫酸铵分级 (35-55%) Sepharose CL-6B 凝胶过滤DEAE Sepharose 离子交换 (mg) (U) (U/mg) (fold) (%) 1,070 800 250 53 8.6 9,672 12,555 6,610 5,789 2,960 抽提 100 g 水稻成熟期谷粒 蔗 糖 合 成酶的纯化表：纯化 步骤全 蛋 白质 回 收 率 全 部 活 性 比 活 性 纯化倍数 粗抽提液鱼精蛋白沉淀后上清 硫酸铵分级 (35-55%) Sepharose CL-6B 凝胶过滤DEAE Sepharose 离子交换 (mg) (U) (U/mg) (fold) (%) 1,070 800 250 53 8.6 9,672 12,555 6,610 5,789 2,960 9.0 15.7 26.4 111.3 344.2 1.0 1.7 2.9 12.4 38.2 10013068 60 31 抽提 100 g 水稻成熟期谷粒 Complete the following on purification tableProblem set 1 。