免疫室乙肝两对半操作规程一、试验原理“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg、乙型肝炎病 毒表面抗体（HBSAb、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg、乙型肝炎病毒 e抗体（HBeAb、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb此五项指标，目 前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物， 判断是否感染乙 肝与粗估病毒复制水平初步检查两对半中各项试验反应原理如下：1 、 乙型肝炎病毒表面抗原检测：采用ELISA “双抗体夹心法”原理，用抗-HBs包被板条，用HRP 标记抗-HBs为 酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB和过氧化物为底 物当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗 -HBs-HR咛合形成抗-HBs-HBSAg抗-HBs-HRP复合物，加入TM璐物 产生显色反应，反之则无显色反应在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBSA赤在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAg2 、 乙型肝炎病毒表面抗体检测：采用ELISA “双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗 -HBS,采 用HBSA包被反应板，加入待测标本，同时加入HBSAg-HR进行孵育 当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSA弗合并与酶结合物 形成HBSAg抗-HBS-HBSAg-HRpt合物，洗去游离反应物，加入显色 剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS 时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。
采用ELISA “双抗体夹心法”检测，用单抗-HBe包被板条，用 HRPfe记抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB和过氧化物为 底物当标本中存在 HBeA抖，该HBeAgW包被抗-HBe结合并与抗 -HBe-HRP吉合形成抗-HBe-HBeAg抗-HBe-HRPfi合物，力口入TM璐物 产生显色反应，反之则无显色反应在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBeA萨在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAg4 、 乙型肝炎病毒e 抗体检测：采用LEISA ”中和竞争法”检测抗-HBe,用单抗-HBe包被板条， 用HRPte记的多抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB和过氧 化物为底物加入待测的标本，同时加入基因工程HBeAg和多抗-HBe-HRP,当标本中抗-HBe含量高时，则抗-HBe-HRP与HBeAg吉合后 形成游离物被洗涤掉，加入TM璐物时显色淡，反之则显色深在试 验结束时，无颜色或颜色变化微弱的，提示有抗-HBe 存在，显色深时，则提示不存在抗-HBe5 、 乙型肝炎病毒核心抗体检测：采用ELISA ”竞争抑制法”检测抗-HBc,用基因工程重组HBcAg 包被板条，用HRM记的抗-HBc为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB 和过氧化物为底物。
加入待测标本，同时加入抗 -HBc-HRP,与抗原形 成竞争结合，当标本中抗-HBc含量高时，则抗-HBc-HRP与HBcA谒 合少，加入TMBK物时显色淡，反之显色深在试验结束时，无颜色 或颜色变化微弱的，提示有抗-HBc 存在，显色深时，则提示不存在抗-HBc二、样本要求1、无需空腹，可血清或血浆标本；新鲜标本无菌冷藏1周可用；可冷冻保存，但避免反复冻融样品中含叠氮钠会影响结果；高度溶血或没完全收缩的血清样品或有微生物污染的样品可能会引起错误的结果2 、试剂：我室“乙肝两对半”检测试剂盒由上海荣盛生物药业有限公司提供3 、设备：洗板机1 台、酶标仪1 台、微量振荡器1 台、打印机1台、加样器1 把、吸嘴（ 50-250ul ）三、操作步骤1、试剂盒准备试剂贮存在2-8 ℃冰箱，实验前应提前30min 取出，使其恢复至室温，待用2、加样（ 1）准备实验所需反应孔 在以上实验原理中可以看出“乙肝五项”中每个项目必须对应各自反应孔，不可错位摆放，否则直接导致错误报告发出2）乙肝表面抗原：第一步，先加样本100ul ，温育 30-40min ；第二步，加酶结合物50ul （1滴），温育30min,洗板10次，加显色剂 A/B 各 1 滴显色看结果。
具体步骤：采用“两步法”，结果需用酶标仪比色，读取OD直每次试验，每块表面抗原测试板均需要设空白孔 1 孔、阴性对照孔 2 孔、阳性对照孔 1 孔、质控（最低值）孔 1 孔 A ：样品（阴性、阳性、质控）各100ul ，加入各自对应的反应孔中，封板、温育30-40minB: 加酶结合物 1 滴（瓶身垂直滴加，挤掉前面有气泡成分） ，振荡混匀30〃，温育30minC ： 洗板 10 次（最好中间有一次手动拍板） ， 自来水冲洗3-5 遍，拍干D ： 加显色剂A、 B 液各 1 滴， 避光显色 15min， 加终止液 1 滴，酶标仪上比色E ：结果判读临界值（Cutoff ）二阴性对口^平均OD直X2.1（阴性对照OD!<0.05 ,按0.05计算；大于0.05按实际值算）样本OD!>Cutoff值为阳性，
3 ）表面抗体（ 4） e 抗原（ 6） c 抗体此四项具体操作步骤大致相同，均为“一步法” ，因未上酶标仪比色，无需做阴阳性对照，如下：D1 ：取所需反应孔，加样50ulD2 ：加各自对应酶结合物 1 滴（ 50ul ） ，注意： “乙肝 e 抗体”检测（以上海荣盛试剂为例） ， 在加完样本后， 先加 “中和试剂”1 滴，再加“酶结合物” 1 滴，不可漏加D3 ：振荡充分混匀，各温育30minD4 ：洗板 5 次，流水冲洗1-2 遍，拍干板孔D5 :加显色剂A、B各1滴（50ul）,避光显色15minD6 ：结果判读（肉眼）SAg 、eAg:显色（蓝色）为阳性，不显色为阴性eAb、 cAb ：显色（蓝色）为阴性，不显色为阳性严格意义来说，严格按照试剂盒说明书来操作更好须注意“乙肝核心抗体”标本要作 1 ： 30 稀释，血清中若检测到低滴度的抗HBC, 往往只表明既往感染，有流行病学意义，只有检测到高滴度抗体（ 1 ： 30）或连续检测抗体滴度升高，才作为感染指标3、报告模式1 、 1.3.52、 1.4.53、 1.54、 2.55、 2.4.56、 2.47、 28、 59、 4.510 、全阴四、注意事项1 、标本尽量新鲜，血清待完全析出，避免溶血或有污染的标本2 、确保加样量要准确，使用微量移液器手工加样时，每次应该更换吸嘴吸取样本3 、用滴瓶滴加时，请先摇匀，并弃去 1-2 滴后垂直匀速滴加，避免将其内的液体触到或溅到微孔边缘，特别是酶结合物4 、尽量避免微孔中产生气泡5 、封板胶纸不能重复使用6 、水浴温度严格控制在37℃7 、洗板时所用吸水纸请勿反复使用8 、 请勿使用带有纸屑的吸水材料拍板， 以防外源性过氧化物酶类似物或氧化还原物质与显色剂发生反应， 影响反应结果准确性9 、洗板机最好在每次使用前、后用蒸馏水或去离子水冲洗干净，以防管路堵塞或腐蚀10 、浓缩洗涤液为高浓度的磷酸盐，可能会形成结晶，请 37 ℃充分溶解稀释后用11 、洗板机洗液量既要避免过量溢出又能充满反应微孔为宜。