Morpholino 的设计及使用发育生物学家们（他们所使用的模型动物在遗传学方面的研究往往还不完 善，当然有的动物已经研究得很完善了）所面临的很重要的问题之一是如何在生 物体发育时期抑制他们所感兴趣的基因的活动——这样一来生物学家们就可以 研究这个基因的正常的生物学功能了一项被广泛接受的方法是反义技术——尤 其是反义寡核苷酸（morpholino,简称M0）技术在本文中，我们将简述该药 物（指MO）的使用，并举例说明它们如何应用于发育机制的研究我们还将讨 论怎样应用 MO 就会导致产生错误的结果——包括没能将目的基因靶向敲除， 同时我们建议研究人员使用对照实验，这样就能对MO实验作出正确的解释简介为了理解发育早期的分子机制，发育生物学家们长期以来一直希望能有这样 一种技术，即：可以在特定的发育时期、在特定的细胞中阻断特定的基因的表达 这一目标目前还没有实现，尽管研究人员在小鼠胚胎上已经很接近这一最终目标 了——他们使用的方法是靶向突变和Cre重组酶即便如此，仍有很多困难没有 克服：试图干扰某一个基因的功能往往会对另一个基因产生不希望发生的“副作 用”而使用Cre重组酶则需要警惕Cre基因表达时所具有的潜在的毒性作用。
其它物种又如何呢？毫无疑问，对其它脊椎动物和无脊椎动物的研究已经深 入到了研究在发育早期的基本机制的地步，而且与使用哺乳动物胚胎为研究对象 相比，使用这些动物具有很多明显的优势——包括可接受性、成本、时间，此外 这些动物本身就很令人感兴趣在所有这些动物中，目前都还没有建立常规的基 因打靶技术尽管传统的遗传筛查技术在理解某一特定的过程方面具有不可估量 的价值，但它既不能保证具体到特定的目的基因，也不能保证使生物体产生一种 无效突变总之，研究人员需要一种能阻断基因功能的方法显性抑制方法有一 定的应用价值，但不是最佳的选择最佳的选择是具备较高特异性的反义 RNA 技术反义 RNA 技术不但可以用于脊椎动物，还可以应用于组织细胞中，而且 它们在寻找新药方面正在发挥越来越大的作用RNA干扰（RNAi）和寡义反核苷酸（MO）技术对我们理解胚胎发育早期 基因的功能有巨大的影响但这两项技术是否是已经好的足够可信呢？所有的反 义技术都存在“脱靶”的可能这些副作用让人们很难判断最终出现的表型究竟 是靶基因被敲除所导致的还是靶基因以外的其他基因被敲除所导致的要理清这 一问题需要进行全面而又严格的对照试验在这里，我们将讨论用反义技术（主 要集中在 MO 实验及其对照）研究动物发育时采取何种对照试验较为合适，并 针对在斑马鱼和青蛙中进行上述对照实验时提出了若干建议。
这些问题在进行针 对果蝇和哺乳动物细胞的RNA干扰实验时就已经被讨论过在进行针对其它物 种的 MO 实验以及治疗应用时，我们所提出的有关对照试验的部分建议仍然是 很重要的反义技术将反义RNA导入细胞以阻断内源性mRNA的翻译、加工或其稳定性的设想 是在20多年以前提出来的这项技术已经被证明能够成功地抑制外源性RNA（注 射到非洲爪蟾卵母细胞中的外源性RNA）的翻译过程，同时也能抑制内源性 mRNA的翻译而由Heasman和Wylie于1997年开发的反义寡核苷酸技术则能 够让研究人员研究青蛙卵母细胞中从母体遗传来的基因转录本的功能（例如包括 Vg1和VegT基因编码的转录本）在上述例子中，这些反义药物是通过与内源性 的RNA杂交并通过核糖核酸酶H （RNaseH）介导这些内源性RNA的降解而干 扰基因的功能的令人惊讶的是，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans ）中 进行的研究表明，双链RNA同样可以干扰内源性基因的功能这一工作导致了 动物体内小的、非编码的 RNA 家族的发现（这些 RNA 可以调节许多——如果 不是全部的话——基因表达方面的功能） 2006 年的诺贝尔奖就授予了“双链 RNA 介导干扰”这一现象的发现者。
至少在青蛙中，除少数例外情况外，在用传统的反义RNA、反义寡核苷酸 或RNA干扰的方法研究青蛙受精卵中表达的基因的作用时并未获得成功与之 相类似，在斑马鱼中，反义RNA作用的特异性太低，以致这一技术无法实际应 用于针对斑马鱼发育过程中某一特定基因的功能的研究也许以后会有新的方法 使上述技术（如 RNA 干扰）在青蛙和斑马鱼中的应用成为可能，但目前看来这 些技术还是不实用的在确定基因功能时所遇到的这些问题阻碍了发育生物学的发展直到本世纪 初，人们才欣喜地发现寡义反核苷酸（MO）能够在青蛙和斑马鱼体内将特定的 基因靶向敲除MO在研究基因功能方面的威力迅速被人们所知晓并在其它生物 体中得以推广应用，包括热带爪蟾、鸡、海鞘、家鼠的卵母细胞以及紫色海胆 2001年7月的《遗传》杂志（journal Genesis）用一整期特刊的形式通报了 MO 技术在推动发育生物学发展方面的重要性，这一期特刊全部用于介绍在多种生物 体中应用 MO 进行的基因打靶方面的研究MO 是一种人工合成的寡核苷酸序列，其链的长度大约为 25 个碱基左右 其结构与短序列的DNA或RNA类似，只不过是用吗啉环替换了核糖环（图1）。
MO 的这一结构使其仍然能够与核酸分子的碱基互补配对，但与一般的寡核苷酸 相比它具有明显的优势特别的，MO能够抵抗核酸酶的降解，因此其化学特性 十分稳定（详见下文）同时MO的主链不携带负电荷，这意味着MO不易与胞 内的其他组分发生非特异性的反应，因此MO的毒性作用也较低MO并不是通过核糖核酸酶H （RNaseH）的机制来发挥作用的，相反，它 是通过阻断翻译过程而发挥作用的（图2A）最近有实验表明，MO可以阻断 RNA的正常剪接（图2B-E）正如我们在本文中所讨论的，现在MO的用途十 分广泛例如，一项最近的研究表明，理论上有可能使用 MO 在脊椎动物胚胎 （如非洲爪蟾）中进行基因组规模的筛查（正如用RNAi在秀丽隐杆线虫胚胎或 在黑腹果蝇组织细胞中所进行的一样）这项研究还表明带有荧光的MO可被用 于研究MO在胚胎中的分布情况最近，已经有人用光激活的MO来进行基因 敲除后的对照研究，这增加了对胚胎特定区域的基因进行靶向敲除的可能性—— 甚至是在特定发育时期的单个细胞中（图2F）最后,MO还可用来封闭microRNA （研究双链RNA时在动物体内发现的一种非编码RNA家族）的功能MO既可 以封闭成熟的 microRNA 又可以封闭 microRNA 的前体。
反义寡核苷酸在青蛙、斑马鱼和其他生物体中的应用关于MO在发育生物学中的应用的最早的描述出现在8年前（2000年）从 那以后发育生物学界就以极大的热情接纳了 MO技术MO技术简便易行（尤其 是在斑马鱼和青蛙中）、得到的结果精确，这些优点意味着在任何一篇描述了一 个新基因的论文中都不能省略用 MO 对该基因进行敲除实验的内容（这是为了 了解该基因的正常功能）然而，在这种对MO的巨大热情背后有一个不幸的副 作用——由于没有建立合适的对照标准，因此很多发表的研究成果中所描述的表 型很可能是MO “脱靶”将其它基因敲除（而不是将感兴趣的目的基因敲除）后 所导致的我们写作本文的目的之一就是为了讨论这一问题并提出了一系列的标 准化对照措施；我们所提出的这些措施的基础是由Corey和Abrams在2001年 所奠定的阻断翻译的 MO许多研究中使用的MO可以直接阻断目的mRNA的起始编码区这种MO 对那些研究基因组序列未知的模式生物的研究人员特别有吸引力（当然，这一情 况越来越少了），因为这样一来研究人员在不知道目的基因的内含子-外显子的具 体结构的情况下就能阻断目的基因的功能人们已经广泛地研究了如何设计阻断 翻译过程的MO,而且设计时所应遵守的规则相对简单（见表1）。
应用了阻断翻译过程的 MO 的例子是如此之多以致我们很难一一道来在 这里我们只举两例，其中一例来自我们实验室这两个例子都是关于在发育过程 中的某种蛋白质的作用的第一个例子采用的技术路线很直接，而第二个例子主 要是讲如何用检测手段来解决难题在第一个例子中，MO被用来研究Notch信号分子在斑马鱼神经系统发生中 的作用在缺少Notch信号分子的情况下，原本要发育成躯干神经板的细胞结果 却发育成了过量的罗-比（Rohon-Beard）感觉神经元，这表明Notch信号对神经 板的分化是必需的然而，用MO将Neurogenin 1（Neurog 1， 一种原神经蛋白） 敲除后发现Notch信号只有在阻断神经发生中才是必需的，因为在Notch信号分 子和 Neurog 1 分子都缺少的情况下能够形成正常的躯干神经板在第二个例子中，MO被用来研究在早期非洲爪蟾胚胎中激活素（activin） 的功能长期以来一直认为激活素具有强大的诱导两栖类胚胎中胚层分化的能 力，但其在一般发育过程中的作用却一直不清楚，直到 MO 技术出现后人们通 过用 MO 阻断激活素的功能才对其有所了解在这些阻断实验中，有一种 MO 可被用于阻断激活素 B 基因 mRNA 的翻译进而引起发育缺陷，同时伴有若干中 胚层标记物的下调（这种下调具有浓度依赖性）。
同时还设计了一种对照MO （这 种对照 MO 改变了原 MO 末端的 4 个核苷酸），实验表明这种对照 MO 不具有敲 除效应，这提示我们激活素基因敲除后引起的表型是特异的但是，令我们感到 惊讶的是，当我们使用作用靶点位于激活素 mRNA 的 5'端的 MO 时则观察不 到表型——我们原先推测这种 MO 具有同样的阻断激活素 B 基因翻译的效应 最终，我们发现我们实验室从非洲爪蟾中提取并保存的激活素 B 的 mRNA 的 5' 非翻译区的序列与公开公布的不同，也就是说，我们所用的第二种 MO 由于存 在 2 个碱基的差异而无法与靶点结合当我们重新设计了合适的 MO 并把它注 入非洲爪蟾的胚胎中时，敲除表型才再次出现——这表明（但不是证明）M0的 效应是特异性的拯救”实验（详见下文）同样表明 MO 所发挥的效应是特异 性的我们在后来进行的实验中还证明激活素基因功能的丧失会引起参与细胞周 期调控的基因功能失调除在研究激活素 B 的功能时提供了新的方法外，这些 实验还强调在研究中对 MO 作用靶点的序列进行重新测定是很重要的，这样能 避免被单核苷酸多态性位点（SNPs）或公布的测序结果中的错误所误导。
阻断断裂剪接的 MO由于要确保设计的MO （阻断翻译过程的M0）确实能够阻断蛋白合成并表 现出预期的表型（详见下文）存在一定的困难，因此人们开始研究用 MO 阻断 mRNA 前体的断裂剪接甚至引发外显子“跳跃”的可能性抑制断裂剪接过程 的 MO 有如下优势：即，人们可以对这种 MO 的效应进行量化此外，由于这 种 MO 不会影响已经剪接完成的母源性转录本，因此当所研究的基因具有从卵 细胞中遗传来的 mRNA 时其突变后的功能仍然可以被模拟出来阻断断裂剪接 过程的 MO 常常与阻断翻译过程的 MO 平行使用以便让它们的数据相互验证 与阻断翻译过程的 MO 一样，关于使用阻断断裂剪接过程的 MO 也有许多例证 在此我们选择了两个例子，其中一个出自我们的的实验室在第一个例子中， Eisen 的实验室发现，用两种不同的阻断断裂剪接过程的 MO 将斑马鱼 Islet 1 基 因敲除（单独或共同注射）会导致相同的表型在这个例子中，注射了 MO 的 胚胎在发育过程中其运动神经元具备了中间神经元的特征这证明 Islet 1的功能 为促进运动神经元的分化并抑制一些位于腹侧的的中间神经元的分化在第二个例子中， Smith 研究小组研究了神经素营养因子受体的同源蛋白 （NRH1）在青蛙胚胎中胚层形成过程中的功能。
他们设计了两种M0,均以两 种非洲爪蟾的神经素营养因子受体相关蛋白的 mRNA 起始转录位置为作用靶 点实验结果表明NRH1对早期胚胎中Xbra和Chordin基因的表达是必需的， 但Goosecoid基因的表达并不十分地依赖于与NRH1受体有关的信号在热带爪 蟾（一种二倍体生物，其基因组序列已被测定）中使用一种阻断 NRH1 翻译的 MO,以及另外两种阻断正常断裂剪接的MO后仍然可以观察到Xbra和Chordin 基因的下调即，在两种不同的生物体内获得了相似的结果，并且使用的 MO 既有阻断翻译的也有阻断正常断裂剪接的，这一事实提示观察到的效应是特异性 的关于如何设计最好的阻断正常断裂剪接的M0,人们已经作了相当多的工 作与设计阻断翻译的 MO 相反，设计阻断正常断裂剪接的 MO 时并没有一个 普遍的指导原则——因为基因的具体结构和蛋白质的功能区域各不相同例如, 相对于野生型蛋白,这种蛋白质的断裂产物可能会表现出显性负效应,甚至会表 现出持续的活性或者一个内含子没有被剪接掉（如果这样的 mRNA 仍然能被 表达）,则蛋白质的功能可能不会受到影响还有可能使用阻断正常断裂剪接的 MO 后产生了新的断裂和剪接位点,最终导致内含子的一段被留在最终的 mRNA 中,或是外显子的一段被从最终的 mRNA 中剪接掉。
这会引起最终的蛋白产物 发生框移性的插入或缺失重要的是要确定修饰后的 mRNA 序列以及找出该 mRNA 编码的是何种蛋白质如果可能的话,还要研究一下这一蛋白质的功能阻断 MicroRNA 的 MOMicroRNA 是一种短序列（约 22个核苷酸）、非编码的 RNA 分子,可通过 阻断翻译和促进它们的靶mRNA的降解而调节基因表达用反义技术的方法已 经建立了多种 阻断单个 microRNA 功能的 手段最直接的就 是使用与靶 microRNA 完全互补配对的反义寡核苷酸（这些反义寡核苷酸要用一些方法处理 以便增加其稳定性，这些修饰包括引入2' -O-甲基-修饰的核苷酸、磷酯酰连接位点等等；为协助它们释放进入活的小鼠的肝细胞中还应共价连接上胆固醇分 子，如23-mer RNA等）最近，已经开始使用MO以阻断microRNA 了例如, 在斑马鱼中，通过使用能与microRNA-214 （miR-214）结合的MO发现，这种 microRNA可以调节su（fu丿基因的表达 该基因编码一种Hedgehog信号通路的调节分子；而使用能与microRNA-140结合的MO发现这种microRNA可以在腭 部形成的过程中调节Pdgf信号通路。
在非洲爪蟾中，使用2' -O-甲基反义寡核 苷酸可以阻断miR-15和miR-16的活性，使用MO也可以阻断它们的活性，并发 现miR-15和miR-16的作用靶点是II型Nodal受体Acvr2a在一项特别进行的实验中， Schier 和他的同事“保护”了两种斑马鱼的 miR-430的靶基因 ndr 1 （该基因还被称为squint基因，可以编码一种Nodal相关信号分子）和lefty基因（一种Nodal拮抗剂）他们所采用的方法是引入“靶 点保护” 的 MO 分子，这种 MO 可以与 microRNA 互补结合用 MO 保护了 miR-430 对 ndr 1 的抑制作用后发现 Nodal 信号上调，而保护了 miR-430 对 lefty 的抑制作用后发现 Nodal 信号减少这一结果说明应用阻断 microRNA 的 MO 是 可行的，同时也揭示了 miR-430在调节Nodal信号通路中的作用MO 所存在的问题尽管存在上述这些成功的例子，但应用 MO 技术仍存在一定的困难，而且 毫无疑问会产生一些误导性的结果主要的困难是如何解释三种情况的出现（见 表 2）首先，知道敲除的效率是很重要的；其次，要考虑到敲除时“脱靶”的 可能性，即要考虑到 MO 敲除的是一个不相关的基因而不是靶基因的可能。
正 如下文将要讨论的，在解决这些问题时，如果要研究的物种的基因组已经被测序 并被很好地注解则将会提供很大的帮助；第三，如何将 MO 精确地、以可以复 制的量注入胚胎（尤其是很小的胚胎）中有一定的困难同样很重要的是如何解释在使用反义技术研究机制的实验中，所选择的试剂 的实际作用的问题例如，RNAi通过RNaseH的作用而导致mRNA的降解，而 MO 的干扰只是作用在翻译阶段或前体 mRNA 的断裂剪接阶段在所有这些例 子中，如果实验设计的合适，那么由 mRNA 编码的蛋白质就一定会被敲除掉 然而， mRNA 功能的存在与否取决于所使用的反义方法而且在一些例子中， mRNA 的水平甚至会上升——这是胚胎因为蛋白的减少而作出的一种补偿 在 许多情况下这并不重要,但如果RNA除了作mRNA外还能作为其它类型的RNA 发挥作用，那么改变其水平就会有明显的后果例如，敲除VegT基因的mRNA 会引起 VegT 蛋白水平的下降,但同时还会引起非洲爪蟾胚胎植物皮层中 Vg 1 基因mRNA的释放，并引起 V 1蛋白含量的下降同时植物皮层中还有Bicaudal C和Wnt 11基因mRNA的释放仅仅敲掉VegT基因的mRNA后就可以观察到 上述所有现象；被设计用来阻断VegT蛋白翻译的MO （但不会造成VegT基因 mRNA 的降解）对 RNA 的定位没有作用。
在这个特例中，“拯救”实验（即将 VegT基因的mRNA注射到卵母细胞中以代替被敲掉的转录本）提示植物皮层中 Vg 1、Bicaudal C 和 Wnt 11 基因 mRNA 的释放并不会对发育造成明显的影响， 因为注射后的胚胎仍然能形成所有三个胚层在其它的例子中，注射了特定的反 义RNA或MO的胚胎出现的表型的确取决于目的mRNA是否被成功敲除基因敲除后的效应正如前文所讨论的一样，许多研究人员使用 MO 靶向敲除目的 mRNA 的起 始编码区这一方法也许较为简便，但它面临的问题是人们无法确定目的基因是 否被敲掉，因为没有有效的方法来检测目的基因生成的蛋白以及对这种蛋白的敲 除效果如何如果存在一种能在活体中有效作用的抗体，那么应用这种抗体就能 生成所要研究蛋白的高解析度图像——甚至是在单细胞水平上这种抗体能够实 时报告注射了 MO 的胚胎的细胞中蛋白的下调情况然而，在活体中抗体往往 不能很好地发挥作用，因此有必要使用 Western Blotting 的方法不幸的是，这 一技术的一大缺点是其个体敏感度不高，因此人们只能在较大数目的生物群体中 确定 MO 的敲除效果类似的，尽管人们能够用酶活性测定或蛋白凝胶电泳的 方法检测目的蛋白是否存在，但使用这些方法需要有较大的动物数量，而且难以 达到试验所要求的精确度。
很明显， MO 的敲除效率是必需被确定的一个较为普遍的方法是在目的蛋 白上表达一个标签蛋白，例如在目的蛋白上加上流感病毒血凝素（HA）的抗原 决定簇或绿色荧光蛋白（GFP），这样就可以通过标签而知晓MO能够将目的蛋 白敲除这个实验聊胜于无——至少它证明了 MO 能在胞内环境里正确识别其 靶 mRNA ，但它不能证明内源性的蛋白被敲除掉了，也不能推测内源性蛋白的 表达被抑制到了何种程度因此要研究一种基因的产物，最重要的是获得一种高 亲和力的特异性抗体这也许很难并且价格不菲，但毫无疑问这样一种抗体是必 须具备的研究工具被设计用来阻断断裂剪接的MO具有较大的优势，通过PCR （聚合酶链反 应）可以确定 MO 的敲除效率如何——尽管 mRNA 水平下降一半并不一定会导 致蛋白水平跟着下降一半！然而，不正确断裂剪接的 mRNA 前体通常会残留在 胞内，它们在核上的定位可以通过用 RNA 进行原位杂交的方法而观察到——这 也为检测MO的作用效果提供了另外一种方法至于被设计用来阻断特定的microRNA的M0,可以通过Northern Blots或 RNA 原位杂交的方法来估计它们的敲除效率例如， Plasterk 和他的同事研究了 斑马鱼体内miR-375的功能，结果发现这种microRNA对胰岛的形成是必需的。
在进行对照试验期间，一种能与miR-206互补结合的MO被注射到斑马鱼的胚胎 中,随后以一定的间隔对胚胎进行RNA原位杂交或Northern Blots实验实验结 果均表明 miR-206 的水平明显下降，与此一致的是另一种 microRNA——miR-124 （miR-124不受miR-206 MO的影响）的水平也出现了特异性的下降另外还有 实验提示不存在miR-206水平的下降，因为MO干扰了 RNA的提取分离过程， 而不是因为MO影响了 microRNA的稳定性进一步讲，MO抑制了 microRNA 的成熟与此相一致的是，能够与以Drosha和Dicer酶mRNA的裂解位点为作 用靶点的microRNA前体互补结合的MO作用后同样可以引起miR-206的减少尽管MO很稳定，但随着发育的进行，MO的水平也会缓慢地下降而且， 尽管斑马鱼和青蛙的胚胎在发育期体积不会增加，但其细胞核的数目会急剧增 加，因此胞内M0 （阻断剪接的M0）的浓度也会急剧地下降因此，不能认为 在注射后几小时或几天有效的 MO 在经过较长时间后仍然同样有效因此有必 要在整个实验时期内分析MO的作用效果如果一种特异性MO的效力在发育 晚期变得不那么充分了，那么可以使用离子电渗法或电击法来维持生物体或小团 细胞中 MO 的水平。
MO 的“脱靶”效应使用MO时（包括阻断起始编码区的MO和阻断断裂剪接的MO） —个容易 被忽视的问题是 MO 可能存在“脱靶”效应换句话说，它们可能会影响一个 完全不相关的基因的产物的表达，而且观察到的表型可能只是目的基因被部分敲 除后引起的（在最糟糕的情况下，表型与目的基因完全无关）有两例关于 MO “脱靶”效应的公开例子，其试验动物分别为海胆和斑马鱼不幸的是，可能还 有许多其它这样的例子，但很多被忽视了——在这些例子中由 MO 所引起的表 型是非特异性的在第一个例子中，在海胆胚胎中注射了以下两种MO——阻断紫海胆Runt 基因和SpRunt基因的MO——中的一种后可引起早期发育抑制；然而注射另外 两种 MO 中的任何一种可导致原肠胚期发育缺陷前两种 MO 在下调 SpRunt 蛋 白方面更有效，但很明显，它们还能阻断两种不同的组蛋白并引起早期表型其 中一种被命名为ml的MO （该MO阻断的是SpRunt基因的翻译）可以抑制组 蛋白H3的合成；另一种被命名为m4的MO （该MO干扰SpRunt基因mRNA 的断裂剪接）可以抑制组蛋白 H4 的翻译文章作者确信他们在实验中采用了十 分谨慎的对照（见下文），而且他们很清醒地认识到，在一个含有 25 个核苷酸的 MO分子中，只有18个（ml）或20个（m4）能够与靶序列匹配并阻断蛋白合 成的发生。
正如作者所指出的那样，紫海胆的胚胎是在15°C的环境中发育的， 因此与其它物种相比，在海胆中 MO 与目的基因的结合力较低，但能够结合这 一点是毋庸置疑的我们注意到非洲爪蟾的胚胎可以在14C至24C的范围内发 育成熟即，除非有人用实验直接检测同一种 MO 在不同温度下在胚胎发育中 的效力以便找出“结合”与发育温度之间的关系，否则我们就认为注射了 MO 的胚胎在孵育温度较高时其 MO 作用较敏感在斑马鱼的例子中， Julian Lewis 实验室的研究人员原本正在研究膜相关架 构蛋白Magi 1和Notch配体Delta D之间的相互作用有两种MO， 一种可干扰 magi 1 基因 mRNA 的断裂剪接，另一种直接作用于该 mRNA 的翻译起始位点 这两种 MO 可引起胚胎后脑和中脑变窄这一现象具有特异性，因为当研究人 员使用另一种阻断翻译的MO （有5个核苷酸的改变）时这一现象就不再出现 然而，这一现象在之前就被观察到过，并被认为是一种非特异性的 MO 效应 而且由于《发育》杂志（《Development》）的一位审稿人提出了质疑，因此作者进一步证明 deltaD 突变的胚胎不存在脑室缩窄的表型，但这些胚胎在注射了Magi 1基因的MO后却都出现了表型。
即，这说明Magi 1基因的MO可以引起 稳定的表型，但这一表型却是非特异性的在上述实验中观察到的非特异性的神经缺陷，以及所有在斑马鱼中进行的MO 实验中出现的 15-20%的神经缺陷是相似的，其原因是 p53 基因的活化以及 后续由p53诱导的凋亡所致MO活化p53的机制尚不清楚，而且MO显著地活 化了一种截短的p53蛋白（从第113位半胱氨酸之后缺失）的具体情况也是一个 谜 具有全长的p53蛋白对诱导细胞死亡是必需的相反，一种针对p53翻译 起始位点的 MO 在引发非特异性的神经细胞死亡方面却很有效，而且这似乎为 在斑马鱼胚胎中进行的 MO 实验提供了一个有力的附加例证需要额外说明的 一点是：用MO研究涉及p53介导的细胞死亡的发育过程将会困难重重同样的，在使用 MO 的实验中，并不是所有的细胞死亡都是非特异性的 例如，注射MO使细胞色素C氧化酶活性下调后，还发现会引起后脑和神经管 部的细胞死亡，但如果这种MO与一种p53 MO共注射则不会使细胞色素C氧 化酶活性下调这些例子足以说明在早期发育过程中使用MO进行研究的潜在风险那么， 究竟在何种程度上使用正确的对照试验才能使研究人员区分结果的真假呢？合适的对照既然存在前文述及的潜在问题，那么研究人员怎样才能确保它们观察到的表 型是特异性的、以及他们所研究的被敲除的基因序列是准确无误的？我们提出了 若干方案并建议在使用 MO 时将这些方案作为标准的对照措施（见表 3）。
我们 意识到我们所提出的很多对照措施并不是在所有的情况下都是合适的或有效的 然而，我们建议研究人员尽可能多的使用对照措施，这样才能为 MO 的特异性 提供最有力的证据正确的对照结构使用MO进行对照试验时最明显的策略是设立对照动物，对照组动物与MO 注射组动物在各个方面应该相同，唯一不同的是对照组注射的 MO 对目的基因 无干扰作用方法之一是使用其外源性目的基因在所研究的物种中不存在的MO例如，Gene Tools公司提供了一种以人类0 -球蛋白前体mRNA为靶点的 “标准对照 ” MO （www.gene-tools.eom/node/23#standardcontrols）尽管这种 MO 可以在一般性应用 MO 的实验里作为对照，但它并不是在所有应用特异性 MO 的实验里都有对照效应的——特别的，它不能在有关 p53 活性的实验中作对照 （参见前文）因此，对有些实验（例如那些无法进行“拯救”的实验）而言， 所选择的对照MO应以与实验MO结构类似为宜这种MO可以是在实验用的 特异性 MO 的基础上随机修改得到的，或者进行一定的反转，或者使特定几个 核苷酸发生改变不幸的是，在对照 MO 与实验 MO 究竟应该有几个核苷酸的 改变方面人们尚未达成一致意见；而且对于不同的靶序列， MO 所改变的核苷酸 数目也不相同（例如，决定因素包括GC含量、所研究的物种、发育的环境等）。
正如前文所讨论的，倘若在较低的发育温度下将 MO 注入胚胎中，则即使这种 MO 有多个核苷酸的改变，最终也有可能出现敲除表型我们的经验表明：对一个25个核苷酸长度的MO分子而言，在改变4个核 苷酸的情况下，如果将这种修改后的 MO 以高浓度注入斑马鱼的胚胎中则会产 生于实验 MO 类似的敲除效果，但在低浓度注射时则无此现象类似的，在热 带爪蟾中，对一个 25 个核苷酸长度的 MO 分子而言，在改变 5 个核苷酸的情况 下对翻译过程几乎没有影响即，根据上述极为有限的信息，如果 Gene Tools 公司所提供的标准对照 MO 是不合适的，那么我们建议在以下实验中使用改变 了 5 个核苷酸后的 MO 作为对照：注射过程本身、注射了一定量的外源性寡核 苷酸以及注射了特异性的MO据我们所知，尚未有人公布过有关在不同条件下 对改变核苷酸数目最佳的 MO 进行系统对比的实验结果；而且尽管进行这项实 验耗资巨大，但它将为设计对照 MO 提供重要的基本信息同时，在设计 MO 时，用BLAST软件搜索其所提供的序列是一个很明智的方法，而且如果所提供 的序列与目的基因翻译起始位点附近的序列的差异少于5个核苷酸，或者是所提 供的序列的靶基因是一个不相关基因，或是位于一个不相关基因的断裂剪接位点 附近，那么这样的序列是不能使用的。
使用不匹配的 MO我们在上文已经描述了，对 25个核苷酸的 MO 而言，当发生 5 个核苷酸的 改变时就不会对目的 mRNA 的翻译过程造成干扰然而，至少那些与靶序列相 差4个核苷酸的MO仍旧具有干扰作用——至少在高浓度注射时是这样回答 “一条25 个核苷酸长度的分子是如何识别与靶序列不同的其它序列的”这一问 题是很有意义的根据热带爪蟾的基因组数据所作的理论计算表明：对一条与靶 序列相差4个核苷酸的M0 （阻断翻译的M0）分子而言，它有30%的可能性与 靶序列翻译起始位点附近的其它序列结合如果把这种MO对mRNA的断裂剪 接的干扰也考虑在内，那么“脱靶”效应发生的概率将增加到50%因此，使用 与靶序列有 3 或 4 个核苷酸不匹配的 MO 分子所获得的表型是相对不稳定的， 但可以确定的一点是，即使一种对照MO未引起表型，实验组用“特异性” MO 所引发的表型也有可能是一种假象因此，尽管使用有5个核苷酸不匹配的MO 是明智的，但由于这种对照手段固有的不完善，因此我们建议使用额外的对照措 施（下文将有描述）我们注意到，尽管这些计算是基于热带爪蟾而得出的，但 其结论对于某些脊椎动物仍是适用的，因为这些脊椎动物的基因组大小与热带爪 蟾具有可比性。
使用作用于同一基因靶点的不同 MO上文所提出的令人失望的计算结果表明，对所有用于研究胚胎发育的 MO 而言，几乎每2种里就有1种是非特异性的乍一看上去，MO是没什么意义的: 非特异性率如此高的实验还怎么能解释的通？但在实际操作中情况没有这么糟 糕发生“脱靶”现象的可能性似乎要低得多，而且通过额外设计一种MO （这 种 MO 与目的基因完全不互补）可以更有效地对实验结果进行解释两种 MO 都产生“脱靶”效应的概率是0.25 （50%X50%）,但这两种“脱靶”效应完全 一样的概率就很低了即，如果有两种 MO 引起的表型是相似的，那么人们就 可以确信这两种 MO 对目的基因所产生的效应几乎没有区别；如果这两种 MO 被同时以低浓度（高浓度会引起副作用）注入胚胎中出现的表型却与单独注射相 同，那么就更能让人确定了通过建立每种 MO 的“浓度-效应”曲线就可以完 成上述实验一一具体来讲就是用滴定法测试不同浓度的MO,直到获得这种MO 不会引起表型的浓度，然后以这一刚刚不会引起表型的浓度将两种MO共注射 在开展这项实验时，有必要高度注意的是要控制注射的体积，以及实验至少要重 复三次这些提醒是很重要的，因为在这种定量实验中，注射体积多出两到三倍 就会产生完全错误的结果。
在实际操作时，正如前文所讲的针对 SpRunt 基因所进行的实验那样，用 3 种甚至 4 种以目的基因为靶点的 MO 可以提高实验的敏感度其中 2 种可以被 设计用来阻断蛋白的翻译过程；另外两种可以被设计用来阻断 mRNA 的正确断 裂剪接对这样的实验的结果进行解释时必须考虑到，不同的 MO 可能有不同 的“通透性”如此一来当一种MO为高浓度时产生的表型可能与另一种MO低 浓度时产生的表型一致也就是说，实验人员需要建立一条“浓度-效应”曲线 并对每种 MO 都要注射多个不同的浓度，这样才能进行合理的比较最后，作为一种使用不同 MO 时的取舍，我们认为应尽可能使用亲缘关系 接近的动物以便于对 MO 产生的表型进行判断例如，可以在非洲爪蟾和热带 爪蟾中检测NRH 1基因的功能但在进行上述实验时要注意，在不同种属间比 较可能会产生严重的错误例如， Fgf8 基因对鳍条鱼和四足动物的心脏发育是 必需的，但对斑马鱼和三棘刺鱼而言，起这一作用的基因分别是 fgf8a 和 fgf8b 这表明对斑马鱼和三棘刺鱼的共同祖先而言,这两种fgf8基因在心脏发生方面的 功能是保守的（此时斑马鱼和三棘刺鱼的共同祖先已经从这两者与鳍条鱼的共同 祖先中分化出来了），但这两种旁系同源物的表达是分开进行的。
很有趣的一点 是，在将来可以设计针对四倍体生物非洲爪蟾的不同旁系同源物的M0,以便研 究这些旁系同源物是否具有不同的功能并将获得的表型与二倍体生物热带爪蟾 所表现出的表型进行比较总之，在考虑了上述诸多问题后我们建议读者：对任何一个基因而言，至少 应该设计两种M0,如果可能的话，要有一种能阻断前体mRNA正确断裂剪接 的MO——即使没有合适的抗体，这也能对MO的敲除效果进行一定的量化我 们建议，对每一种 MO 而言，最好能建立它的“浓度-效应”曲线，同样应该进 行的实验是在低于阈浓度的条件下进行两种 MO 的共注射以便研究这两种 MO 的共同效果拯救实验上面所讲的所有的对照试验都是不完善的MO产生“脱靶”效应是普遍存 在的现象，而且用注射另外一种MO （比如以p53基因为靶点的MO）来缓和这 种“脱靶”的方法并不总是可行的因此，最可信的对照方法是将所研究基因的 产物注入胚胎中进行“拯救”实验——基因产物应不与 MO 发生反应，最常采 用的方法是在胚胎发育的1细胞期注射RNA如果所使用的MO的作用靶点是 翻译起始位点，那么可以去掉 mRNA 的 5'非翻译区或在编码区引入沉默突变 后再注射。
对于阻断 mRNA 前体断裂剪接的 MO 则不存在上述困难正如上文 所提到的，不同的 MO 有不同的“通透性”，对不同的 mRNA 来说也是一样即， 在进行拯救实验时，很重要的一点是要控制注射的 MO 和 mRNA 处在一个合适 的水平因此我们建议要特别注意注射量的大小、注意注射不同的浓度，以及注 意要将同一批分别注射了 MO或（MO+mRNA）的胚胎进行比较对于那些表达广泛的基因或不存在过表达表型的基因，可以直接进行拯救实 验然而，对那些以特殊方式表达的基因，或者是有严重的过表达表型的基因， 要想进行真正的拯救实验是很困难的，甚至是不可能的特别的，要进行拯救就 必须要使这些基因以合适的水平、正确的空间模式表达才行——在某些情况下， 要作到这一点是很难的，甚至是不可能的，但是对这些基因进行分子检测是可行 的例如，将中胚层诱导因子敲除后是不能进行拯救实验的，因为中胚层诱导因 子的表达具有精确的时空特异性；但是对中胚层诱导因子的一个或多个靶基因的 表达情况进行分析则是可行的结论通过本文的描述我们可以很清楚地看出：MO技术是研究早期发育的有力工 具的确，在有些情况下，如果有人想知道一个基因的功能，那么目前来看除了 MO 技术外就没有其它的选择了。
但我们应该同样清醒地认识到的是，对 MO 实 验结果的解释（和一般的其它实验一样）完全取决于合适的对照正是对照实验 使得研究人员能够判断出那些是“脱靶”效应，并且使他们对 MO 的特异性和 结果的可信性具有极大的信心随着研究人员设计出了越来越多的关于 MO 的 复杂的应用，我们也越来越有理由相信他们也能提出一样复杂的对照实验因此， 我们最后的、也是最郑重的建议是要认真地使用对照实验，不论是对实验人员还是对审稿人员而言图1： DNA分子和吗啉寡核苷酸（MO）的结构A） —般的DNA核糖核苷酸B）吗啉寡核苷酸注意B图中的六元吗啉环以及两个六元环之间的非离子型 苯基磷二酰胺键MO btocks mov&jTi§rtt erf inhiatkrn complexiiiiimMorpholinoInhibilorRN1A large!Morpholino图2：对反义吗啉寡核苷酸（MO）的不同使用方法A）用吗啉反义寡核苷酸 阻断翻译过程 MO 的作用靶点位于靶序列 5'端的翻译起始位点，可以抑制翻 译起始复合物向下游的移动B-E）使用MO阻断热带爪蟾NRH 1基因的正确 断裂剪接B） NRH 1开始的三个外显子。
箭头所示为用PCR检测MO的敲除 效率时上游引物（片）和下游引物（R］, R2）所在的位置外显子1长326个 bp,内含子1长9013个bp,外显子2长134个bp,内含子2长740个bp，外 显子3长363个bp如果mRNA发生了正确的断裂剪接，那么片和比将不会 产生PCR产物，而F］和R2将产生490bp的产物C）以内含子1为靶点的MO 可以引起内含子1不被剪接掉，这会导致NRH 1蛋白的前15个正确的氨基酸后 增加了67个错义的氨基酸（除非遇到终止密码子）如果内含子1未被剪接掉, 那么F1和R］将产生280bp长的PCR产物，而F1和R2将产生9.0kb的产物D） 以△外显子2为靶点的MO可以引起外显子2被从成熟的RNA中剪接掉在这 种情况下，外显子 3 将不再与外显子 1 构成完整的读码框，而且会生成一种截短 的蛋白质（前15个氨基酸是正确的，后面接有25个错义氨基酸）由于外显子 2被剪接掉，因此F1和R］将不会产生PCR产物，而F1和R2将产生360bp长的 PCR产物E）验证针对内含子1和△外显子2的MO的敲除效率比较泳道 2和泳道3,以及泳道6和泳道7,可以看出这两种MO将转录本水平下调的程 度均在50%以上。
注意泳道4中原本应该存在的9.5kb的条带是缺失的，可能是 由于对这么长的片段而言PCR条件不适宜所致F）失活MO的活化一种抑 制性寡核苷酸与一条MO发生了特异性结合，用放射线（波长360nm,照射时 间10秒钟）使二者解聚，MO被释放出来并发挥效应表1.阻断翻译的MO的设计（可参考www.gene-）・MO的长度一般为25个核苷酸，GC含量约为50%，不应具有二级结构•设计的MO应该与目的mRNA的5'帽区和3' AUG翻译起始位点之间的某 一段25bp长的序列完全互补如果结合区位于3'翻译起始位点以外，那么MO 的效力就会急剧下降•应用BLAST搜索并使用该软件所提供的序列与MO序列进行比对是一个明智 的办法同时可以生成与该序列相似的、但在所研究的生物体内并不存在的MO 序列用作对照•对MO作用的靶基因进行重新测序是有必要的——这样可以避免被SNP位点 或错误的测序结果所误导・MO应当溶解后保存在-20°CMO可以被加热到65°C并在注射之前应置于冰 上保存溶解后的MO的浓度可以通过其在265nm处的吸光度而被计算出来表 2. 使用 MO 时的 3 个潜在问题・如果没有好用的抗体的话，估计MO的敲除效率是很困难的。
•很难避免 MO 在将靶基因敲除掉的同时将一个不相关的基因敲除掉•特别的，对较小的胚胎而言，很难精确地控制注射的MO的量的多少表 3. 对我们所提建议的一个总结•与现有的突变进行比较如果所要研究的基因中存在突变位点，那么应该对突 变表型和 MO 注射后的胚胎的表型进行仔细的比较这样可以发现是否有 MO 的“脱靶”效应•蛋白的敲除不论何时，只要有可能，都应该用Western或其他检测方法分析 每种MO对蛋白水平的影响•前体mRNA不正确的断裂剪接可以用阻断断裂剪接的MO来研究有多个外 显子的基因的功能阻断断裂剪接的MO的敲除效率可以用RT-PCR的方法来检 测；最终产生的转录产物可以通过测序的方法来研究——如果需要的话还应该研 究这些转录产物所翻译生成的蛋白质的功能另外，可以用RNA原位杂交的方 法来确定细胞核中是否存在未剪接的前体mRNA•将MO的“脱靶”效应最小化针对目的基因至少应该设计两种MO,最好 既有阻断翻译过程的，也有阻断断裂剪接过程的这些 MO 应该被分别检测以 确保它们能产生相似的表型，同时也要检测它们的共同作用随后要用滴定法检 测这些 MO 的阈浓度，然后将这两种 MO 共注射到胚胎中以研究是否会出现与 单独注射时一样的表型。
重要的是要确保在这些实验中注射MO的量是一致的・RNA拯救将靶基因的一种mRNA （该mRNA不会与MO反应）与MO共 注射可用于研究MO的效果是否是特异性的对于干扰断裂剪接过程的M0,用 于拯救的RNA可采用野生型的；对于阻断翻译过程的M0,用于拯救的RNA应 当不与 MO 发生反应要达到这一目的可采用的方法是,将5'非翻译区的部分 片段移除或是在编码区引入沉默突变•对照MO通常都需要使用对照M0可以采用标准的对照MO——这种MO 的靶基因在所研究的细胞中是不表达的或者是采用不匹配的 M0、竞争性的 MO或反转的M0我们倾向于使用有5个碱基错配的M0,因为这种MO与实 验组用的 MO 在结构上最相似,但在某些情况下使用其它的对照 MO 可能会更 合适。