酒精发酵实验方案一、实验目的1. 掌握酵母菌的筛选方法2. 复习用显微镜观察菌形态的操作步骤3. 掌握酵母生产性能的测定：酵母凝聚性的测定、酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的 测定、及其乃酒精的能力、4. 掌握用DNS法测定还原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力5. 学习酒精出酒率的计算二、实验器材1. 实验器材恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电磁炉，水浴锅，微波炉，移液枪，枪 头，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，连通器，天平，酒精 计，超净工作台， 摇床，试管，紫外分光光度仪，培养皿，玻璃棒，涂布棒，离心管，离心机，漏斗，滤纸， 玻璃珠，pH试纸2.试剂及药品碘液，20%盐酸溶液，20%氢氧化钠溶液，500?g/ml标准 葡萄糖溶液，玉米粉，糖化酶，马铃薯，酒糟，无水乙醇，蒸馏水，DNS试剂，可溶性淀粉， 葡萄糖3.实验材料番茄4.实验培养基PDA马铃薯蔗糖（或葡糖糖）琼脂水PH200g 20g 15-20g 1000ml自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，用纱布过滤，在加糖和琼脂， 定容至1000ml121°C灭菌30minDNS试剂酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中， 加热，于热溶液中依次加入3, 5二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶， 冷却后用蒸馏水定容至100ml发酵工艺（技术路线）三、实验步骤（一）酵母菌种的驯化筛选1.酵母菌种的筛选分离筛选采用平板涂布法和划线法。
将 榨取的番茄汁稀释到10-3、10-4、10-5后在PDA培养基平板上涂布，后置于28C隔水式 恒温培养箱中静止培养3 d；从分离得到的酵母菌落中挑取一环酵母菌在PDA平板上划 线，后置于28C隔水式恒温培养箱中静止培养2 d2. 酒精发酵液的微生物检查1）酵母形态的观察用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行 制片，在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小， 并进行死活鉴别二）测定指标及其方法1.酵母生产性能鉴定（1）酵母菌产酒精能力（发酵力）的测定本实验主要采取称重法与 测放出的CO2量等测定酵母的发酵力称重法：我们将不同酵母菌产酒精能力的测定和酒 精发酵合在一起2.操作：①糊化：将625mL水加到糖化锅中，按照料水比1： 5称取玉米粉125g，在电炉 上加热并搅拌，调节pH5.5〜6.0，观察现象，记录下黏度迅速增加时的温度②糖化：待 醪液冷却到60°C，调节pH值至4.0 —4.5，用移液枪（按0.6〜0.8%/g淀粉）量取糖化 酶加入糖化锅中，搅拌均匀，放入水浴锅中，保持温度为60C，维持约10h，用碘液测定 糖化液是否含还有淀粉，若未完全则继续糖化直至完全为止。
注意开始时液面位置并随时 补足由于水的蒸发造成的液面降低③糖化结束后将糖液pH值调至5.0左右④取一 些糖化好的糖化液，测定其还原糖的含量（用DNS法测定）⑤将糖化好的糖化液分装5 个250毫升的三角瓶（每个约150毫升），接种培养24小时的酵母菌，接种量为发酵液 的10% （约15毫升）⑥用干布将三角瓶各部分擦干净，称量初始发酵液的重量，将 发酵液放于28-30C的培养箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止2） 酵母菌耐酒精能力的测定：将产酒精能力最强的菌体用去离子水洗涤2次，后于30C 和不同的酒精浓度（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%）条件下进行试验，定期取样检测活 细胞目：菌体的耐酒精能力以酵母细胞增长数表示，酵母细胞增长数（%） = （C1-C0/ t）X100%，1和C0分别表示发酵时间为t小时的细胞数和刚开始C时的细胞数，以表 示酵母菌在不同的酒精浓度下的耐酒精能力，连续观察5天3）酵母凝聚性的测定本实 验采用本斯值法将酵母茵在30C度摇床中摇瓶培养36 ^离心弃上清液，经无菌水洗 涤3次后，称重1 g酵母菌泥于刻度15 mL的离心管中，注入10 mL pH值为4.5的醋 酸盐缓冲液，20C水浴中放置20 min后，摇动离心管5 min使酵母细胞重新均匀悬浮， 静置，记录i0 min时酵母细胞沉淀的毫升数，即为本斯值。
根据本斯值判断酵母菌株的 凝聚性强弱三）发酵前后发酵液中还原糖含量的测定（DNS法）发酵前后发酵液中还原糖含量的测 定（酵液中还原糖含量的测定本实验采用DNS法，利用可见光分光光度计，在540nm波 长下进行比色测 定，测定酒样的光密度值，确定番茄酒中总糖含量，操作简捷，杂质干扰 少酶活的定义：1mL酶液于上述条件下，1min内产生1?mol葡萄糖量的酶量定义为1 个酶活力单位“IU”1）标准曲线的绘制本实验采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法 （DNS）测定酶解液中还原糖含量，按表1进行葡萄糖标准曲线溶液配置，用分光光度计 540 nm下进行比色测定，用 空白管溶液调零后，测定各管光密度值，以葡萄糖浓度为横坐 标，光密度值为纵 坐标，绘制标准曲线，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量表1葡 萄糖标准曲线溶液配置表 Tablel Preparation of solution for glucose standard curve 项目空白 0 0 2.0 1.5 1 0.2 0.2 1.8 1.5 2 0.4 0.4 1.6 1.5 3 0.6 0.6 1.4 1.5 4 0.8 0.8 1.2 1.5 5 1.0 1.0 1.0 1.5 6 1.2 1.2 0.8 1.5 7 1.4 1.4 0.6 1.5 8 1.6 1 .6 0.4 1.5含糖总量(mg)葡萄糖液(mL)蒸馏水(mL) DNS试剂(mL)加热冷却蒸馏水定容沸水 浴加热10 min立即用流水冷却 定容至25 mL 2)发酵前后发酵液中还原糖含量的测定 取 5ml糖化液进行过滤，滤液用pH4.6的醋酸盐缓冲液进行稀释，大约稀释10倍。
取甲、 乙两支试管，甲试管加入1ml稀释的糖化液，乙管加入1mlpH4.6的缓冲液，分别加入 2mlpH4.6的醋酸盐缓冲液和2mlDNS试剂混匀后沸水浴加热5min，立即冷却定容到 5ml混匀分别于540nm处比色，用乙管调零，测3次，记录光密度值然后在标准曲线 上查得相应的还原糖含量G mg再由下式计算样品中还原糖的含量：还原糖含量(mg/ mL)= Ga式中：a 一稀释倍数G 一还原糖量(mg)(四) 酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定原理：原理：糖化型淀粉酶是一类酶的总称 共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖 或葡萄糖，包括淀粉-1，4-麦芽糖苷酶(p -淀粉酶)、 淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶(糖化酶)和淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)本实验的 研究对象是淀粉a -1， 4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原 性末端开始，分解a -1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以 表示糖化性淀粉酶的活力碘量法原理：碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖， 葡萄糖具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化I2+2NaOH-NaIO+NaI+H2O NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO—CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫 代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。
I2+2Na2S2O3-Na2S4O6+2NaI仪 器：仪器：吸管(25ml、10ml、5ml、2ml)定碘瓶；碱式滴定管；恒温水浴锅；分析天平 试剂：试剂：(1)2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g (预先100°C烘干约2h至恒重)， 用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液 需当天配制2) 0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa・3H2O)2.722， 用蒸馏水溶解，定容至100m1冰醋 酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀缓 冲液以酸度计或精密试纸校正pH (3) 20%氢氧化钠溶液(4) 0.1mol/L碘液称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至1000ml贮存 于棕色瓶中5） 0.1mo1/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml （6）1mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 ml蒸馏水中，冷却后定容至100ml，摇匀7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠 （Na2S2O3・5H2O）24.82g和碳酸钠约0.2g （硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮 沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容 至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。
贮 于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用实验步骤：1.待测酶液的制备.取发酵液的滤液用pH4.6醋酸钠缓冲液适当稀释，供 测定用2.酶活力的测定.于甲、乙两支管中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及 0.2mol/LpH4.6的乙酸缓冲液5ml，摇匀，在40°C的恒温水浴中预热5-10min，在甲管中 加入待测酶液2ml（酶活总量约100-170单位），乙管中加2ml蒸馏水作对照，摇匀，立即 记时准确反应1h后，取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温取上 述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠 15ml，摇匀后暗处放置15min加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至 无色为终点其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液 的稀释倍数计算：计算：糖化酶活力单位的定义：在40C、pH4.6的条件下，1小时 水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位酶活力单位=（A-B）N X90.05 X（1/2） X（32.2/5） Xn式中：A——空白所消耗硫代硫酸钠体积 （ml）； B——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； N——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L）；90.05 1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质（mg）； 1/2 折算成1m1酶液 的量32.2——反应液总体积（ml） 5 ——吸取反应液样品的体积（ml）； n ——酶液稀 释倍数。
注意事项：注意事项：1）酶液制备时，酶液浓度最好控制在消耗0.05mol/L硫 代硫酸钠（空白和样品）的差数为3〜6ml左右（以每毫升约50~90单位为宜）2）配制 碘液时碘先和碘化钾溶解，溶解完全后再稀释五）酒精蒸馏与含量的测定：酒精蒸馏与含量的测定比重计测定法：1.材料：①酒精 比重计②100ml量筒③温度计2.操作:①蒸馏:装好全套蒸馏装置，用容量瓶量取100ml 发酵液，放入500ml的蒸馏瓶中，加100ml水迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，并将此容 量瓶用水洗 净后，置冷凝管下端收集馏出液100ml，停止蒸馏，摇匀备用②测定：将酒 精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计插在比重计 杆旁，待温度稳定后， 酒精停稳时读数，读数应以弯月面下缘为准，观察视线要与弯月面下缘相平③校正：根 据所量的酒精度和温度、查表校正为20°C时酒精度实际发酵产无水酒精发酵率（%）=理 论发酵产无水酒精X100成熟发酵醪中含酒精=发酵液中糖份％ X 0.6479 X100 0.6479 一发酵糖转化为酒精的转化系数（六）计算酒精出酒率葡萄糖发酵生成乙醇的反应式为： C6H12O6-2C2H5OH+2CO2由于淀粉糖化液中几乎都是可发酵性糖，可按照上式算出糖醇转化 的理论值。
糖利用率=（实际所得酒精量/理论上所得酒精量）X100%酒精对糖或对淀粉 的转化率是衡量酒精生产水平的一项重要指标，直接影响生产成本它与酵母的活性及用 量、发酵时间、温度、pH值及是否污染上杂菌等许多因素都有关，由于本实验没有最终获 得酒精产品，所以，仅根据发酵醪体积和酒精含量估算转化率，也可利用CO2的产生量计 算酒精产量并对结果应进行讨论实际发酵产无水酒精发酵率（%）=理论发酵产无水酒 精X100%成熟发酵醪中含酒精=发酵液中糖份％ X 0.6479 X100% 0.6479 —发酵糖转化 为酒精的转化系数淀粉出酒率=（发酵生产中的酒精总量/商品淀粉中的纯淀粉含量）X100% 淀粉利用率=（发酵生产中的酒精总量/理论上应得的酒精量）X100%上式中，发酵生产出 的酒精总含量可根据发酵醪和酒精含量估算，也可利用CO2的产生量计算酒精产量；一般 商品淀粉中纯淀粉的含量为81.12%；由400g商品淀粉出发发酵生产酒精时，理论上应得 的酒精量，最后计算约为184g五、 实验结果六、 实验记录。