1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成阅读教材阅读教材P8-11如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因（1 1）.基因文库基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
有这种生物的不同基因，称为基因文库种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分 基因，如：基因，如：cDNAcDNA文库文库非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质不编码蛋白质编码蛋白质：编码蛋白质,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点:真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用：有调控作用,上游有上游有RNARNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点(启动子启动子)。
非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的，边的，边_边边_编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的，先的，先_后后_相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码转录转录翻译翻译转录转录翻译翻译1 1下列关于基因结构的认识中，正确的是下列关于基因结构的认识中，正确的是 （）A A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C C大肠杆菌基因与大肠杆菌基因与RNARNA聚合酶结合位点位于编码区的下游聚合酶结合位点位于编码区的下游D D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2 2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是 （）A A编码区都有能编码蛋白质的序列编码区都有能编码蛋白质的序列B B编码区都是连续的编码区都是连续的C C非编码区都能调控遗传信息的表达非编码区都能调控遗传信息的表达D D非编码区都有非编码区都有RNARNA聚合酶结合的位点聚合酶结合的位点DACD提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存（2 2）.基因文库的构建方法基因文库的构建方法基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的某器官某器官或或特定发育时期特定发育时期的的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存 cDNA cDNA文库的构建文库的构建-反转录法：反转录法：（cDNA）DNA聚合酶聚合酶 真核生物的基因用逆转录法得到的真核生物的基因用逆转录法得到的cDNAcDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？核生物基因呢？思考？思考？DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码系列系列。
即不即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子（3 3）构建基因文库的目的）构建基因文库的目的 怎样从基因文库中得到我们所怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢需的目的基因呢?便于在便于在不知道目的基因核苷酸序列不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因的情况下，获得所需的目的基因依据：目的基因的有关信息依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性（4 4）从基因文库中得到目的基因的方法）从基因文库中得到目的基因的方法直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)直接分离法直接分离法供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离(鸟枪法鸟枪法)回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？多用于原核生物多用于原核生物某生物体内全部某生物体内全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接导入与运载体连接导入基因组文库基因组文库cDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接导入与运载体连接导入部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNA基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。
的核酸合成技术原理：原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制PCRPCR技术技术 原理：原理：前提：前提：原料：原料：优点优点 过程：过程：PCRPCR扩增仪扩增仪DNADNA复制复制已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因在短时间内大量扩增目的基因指数指数模板模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核引物；四种脱氧核苷酸；热稳定苷酸；热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；离子酶）；离子变性变性 复性复性延伸延伸过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6055-60）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模的作用下，合成与模板互补的板互补的_氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复步骤：每重复一次，目的基因增加一次，目的基因增加_倍倍一一方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循环的次数）环的次数）条件：条件：_、_ _、_ _、_ _、前提条件、前提条件:_:_ 结果：结果：模板模板DNA(DNA(含目的基因含目的基因)四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使使_在短时间内成百万倍地扩增在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段DNADNA复制复制PCRPCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATPATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNADNA连接酶等连接酶等蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测3 3、人工合成法：、人工合成法：在在基因较小，核苷酸序列已知的基因较小，核苷酸序列已知的情况下，情况下，可以利用可以利用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成 化学法合成的目化学法合成的目的基因含的基因含内含子、启内含子、启动子和终止子动子和终止子吗？吗？反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成人工合成法（人工合成法（真核生物真核生物）推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法化学合成法化学合成法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNAcDNA文库文库课堂小结：课堂小结：2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.A.B.B.C.C.D.D.1 1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是因的最方便方法是A A、化学合成法、化学合成法 B B、基因组文库法、基因组文库法 C C、CDNACDNA文库法文库法 D D、聚合酶链反应、聚合酶链反应4 4、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共在基因工程中，把选出的一个目的基因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩增仪中扩增扩增仪中扩增4 4次，那么，在扩增次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个）个A.540A.540 B.8100 C.17280 D.7560 B.8100 C.17280 D.75603 3、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCRPCR技技术扩增目的基因术扩增目的基因 反转录法反转录法 通过通过DNADNA合成合成仪利用化学方法人工合成仪利用化学方法人工合成A A B B C C D DD D1.1.加热至加热至9595摄氏度的目的是使摄氏度的目的是使DNADNA中的中的 断裂，这一过程在细胞内是通过断裂，这一过程在细胞内是通过 的作的作用来完成的。
用来完成的2.2.当温度降低时，引物与模板末端结合，在当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNADNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2 2个个DNADNA分子，此过程中的原料分子，此过程中的原料 ，遵循的原则是遵循的原则是 3.3.TaqTaq酶的特点是（酶的特点是（）A.A.耐强酸耐强酸 B.B.耐强碱耐强碱 C.C.耐高温耐高温 D.D.最适温度最适温度3737摄氏度摄氏度 在遗传工程中，若有一个控制有利性状的在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNADNA分分子片段为子片段为ATGTGATGTGTACACTACAC，要使其数量增多，可用，要使其数量增多，可用PCRPCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链双链DNADNA分子为模板分子为模板 ATGTGATGTG或或TACACTACAC模板链模板链 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 四种核苷酸四种核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶 引物引物 温度变化温度变化 恒温恒温A A B BC C D DD D（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。
2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程:外源外源DNADNA质质粒粒酶切位点酶切位点酶切酶切酶切酶切混合混合DNADNA连接酶连接酶目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个黏性末端两个黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们所处的位置和有什么作用？它们所处的位置和有什么作用？a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因位于基因的位于基因的首端首端位于基因的位于基因的末端末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞3 3、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a a使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在并并遗传遗传给子给子代代b b、同时使目的基因能、同时使目的基因能表达和发挥作用表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。
因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等必须构建上述元件的主要理由是必须构建上述元件的主要理由是：（1 1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2 2）通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；码序列导入受体生物中无法转录；（3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；其他调控元件，如增强子等；（5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。
表达载体在载体片段表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去达载体的方式携带进去注意注意目的基因与运载体结合所需的条件有目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶同一种限制酶 具有抗性基因的质粒具有抗性基因的质粒 RNARNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DNADNA连接酶连接酶 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 ATP ATP A A B BC C D D（多选）一个基因表达载体的构建应包括（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A A目的基因目的基因 B B启动子启动子 C C终止子终止子 D D标记基因标记基因ABCDABCDD D下列关于基因表达载体的叙述不正确的是下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A A启动子是与启动子是与RNARNA聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，是起始密码是起始密码B B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNADNA短片段，短片段，对对mRNAmRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选的基因从而便于筛选D D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别式不同而有所差别A转化：转化：目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达方法：方法：将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：农杆菌转化法农杆菌转化法（双子叶植物和祼子植物）（双子叶植物和祼子植物）基因枪法基因枪法（单子叶植物）（单子叶植物）花粉管通道法花粉管通道法将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 显微注射法显微注射法将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞（感受态细胞（用用CaCa2+2+处理）；电激或热激处理）；电激或热激1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对大多数单子叶植物无感染能力大多数单子叶植物无感染能力TiTi质粒质粒的的TDNATDNA可可转移转移至受体细胞至受体细胞并并整合整合到其染色体上到其染色体上转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞整合整合 植物细胞染植物细胞染色体色体DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌整合整合到染色体上到染色体上转移转移至受体细胞至受体细胞（2 2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNADNA打入受体打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法常用于单子叶植常用于单子叶植物的转化方法物的转化方法（2 2）基因枪法）基因枪法微弹轰击法微弹轰击法特点：成本高特点：成本高胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花胚囊花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫早期胚胎早期胚胎新性状动物新性状动物2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞CaCa2+2+处理处理小结小结植物基因植物基因工程工程动物基因动物基因工程工程微生物基微生物基因工程因工程常用方法常用方法受体细胞受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转农杆菌转化法化法显微注显微注射法射法CaCa2+2+处理处理法法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞1 1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是为受体细胞，原因是 A A结构简单、操作方便结构简单、操作方便 B B繁殖速度快繁殖速度快 C C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单 D D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2 2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌大肠杆菌 枯草杆菌枯草杆菌 支原体支原体 动植物细胞动植物细胞A A B B C C D DBD3 3、基因工程是在、基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的，在分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.A.人工合成基因人工合成基因 B.B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C抗虫鉴定抗虫鉴定 抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 (关键步骤关键步骤).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA.用含目的基因的用含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等作片段用放射性同位素等作标记标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中中（1 1）方法）方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程:DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
列的部位，仍然是两条游离的单链二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分子杂交分子杂交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交,若若出现杂交带出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA1 1、鉴定、鉴定分子水平的鉴定分子水平的鉴定提取提取苏云金杆菌苏云金杆菌BtBt毒素蛋白毒素蛋白将将BtBt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗BtBt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道下列属于目的基因检测和鉴定的是道。
下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有目的基因 检测检测受体细胞中是否有致病基因受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是检测目的基因是否转录出否转录出mRNA mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白检测目的基因是否翻译出蛋白质质 A A B B C C D D采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列与细菌质粒重组，序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列与质粒重组，导人序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A A B B C C D DC归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、Ca Ca2+2+处理处理4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u 鉴定：鉴定：（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到类胰岛素，这一过程涉及到A.A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.B.把重组后的把重组后的DNADNA分子导入受体细菌内进行扩增分子导入受体细菌内进行扩增C.C.检测重组检测重组DNADNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.D.筛选出能产生胰岛素的筛选出能产生胰岛素的“工程菌工程菌”培养培养培养培养培养培养导入导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完全培养基的完全培养基含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆两种培养基均不能生长大肠杆菌菌 Ca2+处理细胞处理细胞形成感受态细胞形成感受态细胞检测检测（培养不具有氨苄青霉素（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素只有氨苄青霉素抗性基因质粒抗性基因质粒只具有氨苄青霉素只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉不具有氨苄青霉素素 抗性基因和抗性基因和四环素抗性积基四环素抗性积基因的大肠杆菌因的大肠杆菌完全培养基完全培养基导入导入接种培养接种培养接种培养接种培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大肠杆菌不含大肠杆菌不含抗四环素基因抗四环素基因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因存活存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活存活导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大肠杆菌不含大肠杆菌不含抗四环素基因抗四环素基因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大肠杆菌含抗大肠杆菌含抗四环素基因四环素基因证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因完全培养基完全培养基存活存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？4.4.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（基因（kankan）常作为标记基因，只有含卡那霉素）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。
抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长右图为获得抗虫棉的技术流程请据图回答：右图为获得抗虫棉的技术流程请据图回答：来源来源:学学,科科,网网(1)(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基因的获取、目的基因的获取、_、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞、_2)A(2)A过程需要的酶有过程需要的酶有_ _ _基因表达载体的构建基因表达载体的构建目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定（同一种）限制酶和（同一种）限制酶和DNA连接酶连接酶（3 3）要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用）要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用_处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为_态；态；然后将然后将_在缓冲液中混合培养在缓冲液中混合培养完成转化过程完成转化过程4 4）含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组）含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过C C_和和E E_如要确保再生植株中含有抗如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在虫基因，可在C C过程的培养基中加入过程的培养基中加入_。
Ca2+感受感受重组质粒和感受态细胞重组质粒和感受态细胞脱分化脱分化再分化再分化卡那霉素卡那霉素（5 5）如果转基因植物的花粉中含有毒蛋白，将）如果转基因植物的花粉中含有毒蛋白，将引起的安全性问题包括引起的安全性问题包括_A.A.生物安全生物安全 B.B.环境安全环境安全 C.C.食品安全食品安全 D.D.伦理道德问题伦理道德问题（6 6）抗虫基因能与植物体内基因拼接成功是因）抗虫基因能与植物体内基因拼接成功是因为为 _ _ _ _成功表达成功表达说明苏云金杆菌和植物等生物共用说明苏云金杆菌和植物等生物共用 _ _ ABCABC抗虫基因与植物的抗虫基因与植物的DNADNA的双螺旋结构相同的双螺旋结构相同一套遗传密码一套遗传密码（7 7）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基 因的传递符合孟德尔遗传定律因的传递符合孟德尔遗传定律将转基因植株与将转基因植株与_杂交，其后代中杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1:11:1若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为型与卡那霉素敏感型的数量比为_若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株中抗卡那霉素型作离体培养，则获得的再生植株中抗卡那霉素型植株占植株占_非转基因植株非转基因植株3:11001.1.金花茶是中国特有的观赏品种，但易得枯金花茶是中国特有的观赏品种，但易得枯萎病，降低观赏价值。
科学家在某种植物中找萎病，降低观赏价值科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，用转基因方法培育出了到了抗枯萎病的基因，用转基因方法培育出了抗枯萎病的新品种请据图回答：抗枯萎病的新品种请据图回答：（1 1）将连接到并形成的最大区别：的）将连接到并形成的最大区别：的基因结构的编码区内有基因结构的编码区内有_和和_；而是而是_，它的基因结构的特点是，它的基因结构的特点是_，常用到，常用到的酶是的酶是_和和_外显子外显子 内含子内含子 质粒质粒 基因的编码区是连续的，不间断的基因的编码区是连续的，不间断的 DNA DNA连接酶连接酶限制酶限制酶（2 2）经检测，被侵染的金花茶叶片细胞具备）经检测，被侵染的金花茶叶片细胞具备了抗病性，这说明已经在金花茶细胞内得到了抗病性，这说明已经在金花茶细胞内得到_欲快速培育大量该抗病新品种，应欲快速培育大量该抗病新品种，应该采用的技术为该采用的技术为_植物组织培养植物组织培养表达表达 (2011(2011北京理综，北京理综，31)T31)TDNADNA可随机插入植物可随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变用此方基因组内，导致被插入基因发生突变用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植株形成花蕾时，将地上部分生型拟南芥，待植株形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌浸入农杆菌(其中的其中的T TDNADNA上带有抗除草剂基因上带有抗除草剂基因)悬浮液中以实现转化。
在适宜条件下培养，收悬浮液中以实现转化在适宜条件下培养，收获种子获种子(称为称为T1T1代代)1)(1)为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除要去除_，因为后者产生的，因为后者产生的_会会抑制侧芽的生长抑制侧芽的生长2)(2)为筛选出已转化的个体，需将为筛选出已转化的个体，需将T1T1代播种在含代播种在含_的培养基上生长，成熟的培养基上生长，成熟后自交，收获种子后自交，收获种子(称为称为T2T2代代)顶芽顶芽生长素生长素(一定浓度的一定浓度的)除草剂除草剂(3)(3)为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T2T2代播种在含代播种在含_的培养基的培养基上，获得所需个体上，获得所需个体4)(4)经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体为确定抗盐性状是否由单基因突变变体为确定抗盐性状是否由单基因突变引起，需将该突变体与引起，需将该突变体与_植株进行植株进行杂交，再自交杂交，再自交_代后统计性状分离代后统计性状分离比5)(5)若上述若上述T TDNADNA的插入造成了基因功能丧的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性基因的存在导致植物的抗盐性_(一定浓度的一定浓度的)盐盐野生型野生型1 1 降低降低科学家通过基因工程，成功培育出能抗棉铃虫的科学家通过基因工程，成功培育出能抗棉铃虫的棉花植株棉花植株抗虫棉，其过程大致如下图所示：抗虫棉，其过程大致如下图所示：（1）细菌的基因之所以能在棉花细胞内表达，）细菌的基因之所以能在棉花细胞内表达，产生抗性，其原因是产生抗性，其原因是 _。
它们共用一套遗传密码它们共用一套遗传密码（2 2）上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用的方）上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用的方法是法是_ _ ，这种导入方法较经济、有效这种导入方法较经济、有效目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键关键是是目的基因是否插入到受体细胞染色体目的基因是否插入到受体细胞染色体DNADNA上上，这需，这需要通过检测才能知道，检测采用的最好方法是要通过检测才能知道，检测采用的最好方法是 _ _ 3 3）上述基因工程中的核心步骤是）上述基因工程中的核心步骤是 _ _，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以_给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用4 4）利用基因工程技术培育抗虫棉，相比诱变育种和杂）利用基因工程技术培育抗虫棉，相比诱变育种和杂交育种方法，具有交育种方法，具有_和和_等突出等突出的优点，但是目前基因工程仍不能取代杂交育种和诱变的优点，但是目前基因工程仍不能取代杂交育种和诱变育种。
与基因工程技术相比，杂交育种和诱变育种方法育种与基因工程技术相比，杂交育种和诱变育种方法主要具有主要具有_的优点基因表达载体的构建基因表达载体的构建 遗传遗传 目的性强目的性强 农杆菌转化法农杆菌转化法 DNA DNA分子杂交技术分子杂交技术克服远缘杂交不亲和克服远缘杂交不亲和障碍障碍（或能有效地打破物种的生殖隔离界限）（或能有效地打破物种的生殖隔离界限）操作简便易行操作简便易行。