第四篇 免疫组织化学一、免疫组织化学的定义：（一）什么叫免疫组织化学？简单地说，用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原 或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部 位目前免疫组织化学作为病理诊断，鉴别特殊病例，是不可缺少的最重要的手段，国内在 免疫组织化学的应用方面已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献 抗原（抗原，AG） 它是一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质1） 抗原的性质① 异物性它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物，异体大分子物质可产生 免疫应答目前生物制剂公司利用这一原理生产出许多适合于临床诊断的抗体但是，并非 所有的异物都是抗原例如矽尘等一些生物性高分子聚合物，它们不会刺激机体的免疫系统 产生相应的抗体物质，而只是肺对吸入的矿物性和有机粉尘的非肿瘤性反应［1］矽肺是肺 吸入矽颗粒沉积的结果，也是机体对另一种外来物反应的结果② 理化性状凡具有抗原性的物质，其分子越大，它的免疫原性就越强具有抗原性的物 质，其分子量都较大，起码在一万以上，抗原分子量越大，其相应的表面积也越大，接触、 碰撞免疫细胞的机会就增多，这犹如一颗大树，根深叶茂，占据着大片空间，不易被风刮跑。
抗原性物质由于分子量大，盘踞着较大地方，在体内存留着一定的时间，时间越长，其对机 体的刺激作用就越强③ 特异性各类抗原物质结构繁琐，组成的化学结构也很复杂，但是能够刺激机体并与抗 体发生结合反应的化学组成，仅仅是抗原物质表面的一些具有活性的化学基团，化学结构及 空间构型，称为抗原决定簇即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它的抗原起反 应［2］,这就是抗原的特异性，称之为特异性抗原虽然如此，特异性抗原也只是相对的， 因为人们希望这种特异性抗原只存在于某种细胞及结构而不存在于其它细胞及结构的特有 抗原［3］,但至今为止,仅发现较为狭小范围的特异性抗原，如前列腺特异抗原（Prostatespecific 抗原,PSA），它是由前列腺上皮细胞合成的一种糖蛋白，目前认为是具有特异性的肿瘤标记 物之一，它可以用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断，但不能用于同源的前列腺肿瘤的良 恶性诊断，因为它还不是非常特异性的抗原，前列腺增生的上皮也可以呈阳性反应另外， 不同的抗原物质常含有共同的抗原成份，即一种抗体可与二种以上不同抗原发生反应，这些 抗原称为共同抗原［2］2） 抗原的类型① 肿瘤相关抗原所谓相关抗原，指的是抗原量的差别，某种抗原大量地存在于某种细胞， 但也少量或微量存在于其它细胞［3］。
如细胞角蛋白，它不仅存在于上皮细胞中，也存在于 上皮来源的肿瘤中在判断鉴别这方面的肿瘤时，要特别地小心，不要以为凡是阳性的细胞，都是属于肿瘤细胞， 要有区分主要细胞和非主要细胞的能力，所谓主要细胞是指能给作出诊断的细胞，这些细胞 免疫组化显示阳性才算真正的阳性，其它反应性细胞即使显示阳性，在诊断上也只称为阴性③ 分泌抗原这类抗原主要分布于具有分泌功能的细胞里，这些细胞的内质网可合成分泌 抗原的前身物质，经高尔基体内组装，以分泌颗粒的形式存在于胞浆中，并随着细胞的分泌 功能排出细胞外如腺泡上皮的酶原颗粒、粘液细胞的粘液颗粒以及内分泌细胞和神经内分 泌颗粒［3］④ 吞沉抗原这类抗原并非某一组织细胞的固有的结构抗原，它是机体内的活动所形成的 最终结果例如机体内的吞噬细胞将进入体内的异物、细菌、病毒进行吞噬；g、补体、抗 原抗体复合物在通过血管及毛细血管后，在肾小球基底膜上沉积下来；肾病综合征可见的系 膜增生和IgM的沉积；弥漫性系膜增生性肾小球肾炎有IgM和C3沉积；膜性肾小球肾炎 有 IgG、C3、IgM、IgA 沉积等3）必须对抗原进行纯化（二）为了获得理想的抗体，使免疫组化技术达到定性可靠和定位准确的目的，不论是哪 一种抗原，当被用作免疫组织化学反应时，都必须进行纯化，以排除杂质。
否则，将会产生 非特异性染色，有时微量的杂质也可导致产生大量的抗体因此，用纯化的抗原制备抗体， 才能获得特异性抗体但是，尽管使用高特异性抗体进行免疫组织化学染色，仍会有共同抗 原决定簇所造成的非特异性染色［3］抗体（抗体，AB） 机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体 液免疫应答、B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发 生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体1） 抗体的基本结构抗体的化学结构是由二硫键以共价和非共价的形式联结组成，呈“Y ”形，其中两条长链由450〜550个氨基酸组成，称为重链（Hesvy链,H）,两条短的称为 轻链（光链丄）由214个左右的氨基酸组成2） 抗体的H和L具有可变的部位抗体的“Y”形分叉端（N端），L中约1/2氨基酸和H中1/3〜1/4氨基酸，其组成及排列顺序 随结合抗原特异不同而有所改变，故称可变区，抗原与抗体的结合取决于此区H的2/3〜 3/4和L1/2处，其氨基酸的排列比较稳定，称为稳定区，该区与免疫球蛋白结合补体或巨噬 细胞等生物学活性有关3） 抗体易被水解的区域抗体的铰链位于H、CH1和CH2之间，此区结构松散，易被蛋白酶水解，当用胃蛋白酶水 解时，抗体分子可得到保持有抗体结合抗原双价活性的F（ab'）2片段。
惊人的和F（ab'）2片段 均有抗体活性4） 具有产生相应抗体的功能抗体具有各自不同的氨基酸排列和三维结构，故对于任何不同结构的抗原，机体 的免疫系统都能产生与之相应的抗体目前，世界许多公司利用这一原理，生产出许许多多 适合于临床诊断、预防和治疗的抗体最早制备抗体的方法是将某种天然的抗原经各种途径 免疫动物① 多克隆抗体（Polyclonal抗体，PCAB）抗原进入机体后，刺激了免疫系统，成熟的B 细胞克隆受刺激后，将抗体分泌到血清和体液中当将这些血清收集起来，便可获得抗体 但是此类抗体成份较多，是多种单克隆抗体的混合物［4］，因此PCAB是跟抗原的多个决定 簇起反应的结果，故称多克隆抗体在二十世纪八、九十年代，使用的抗体多为PCAB，女口： CEA、GFAP、NSE、CK、S —100等，于它的不均一性，限制了对抗体的进一步研究和应 用为了进一步的开展工作，研究均一的抗体势在必行② 单克隆抗体（Monoclonal抗体，MCAB指只能跟抗原中的某个决定簇起反应而获得的 抗体称单克隆抗体1925年化妆墨和Milstein首次使用B淋巴细胞杂交瘤技术生产出均一 性的MCAB所谓杂交瘤技术，就是将具有无限繁殖能力并能分泌抗体的骨髓瘤细胞，与 具有分泌抗体能力但不能无限繁殖的B细胞，在一定条件下进行细胞融合，使之产生出双 功能细胞，即能无限度地繁殖又能无限度地分泌抗体的杂交瘤细胞。
然后再经一系列选择培 养、克隆化、分离出单个细胞，使其通过分裂增殖而获得一个遗传特性十分均一的细胞目 前，生物制剂公司所销售的MCAB都是鼠源性的，由于这种生产方式成本较高，因而导致 临床应用的抗体价格较高八十年代产生的基因工程抗体技术是将抗体的基因按不同的需要 进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子？由于这项 技术已被广泛地应用，目前销售于临床作诊断地抗体，价格已有了明显地下降二、免疫组织化学技术的发展概况(一)免疫荧光细胞化学技术1941年，浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原抗体反应的 规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测 组织或细胞内的相应物质应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等在荧光显微 镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位目前，免疫 荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域，如免疫学、微生物学、病理学和临床检 验学等由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的准确性，又由于许 多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞 分类器等，该项技术可发展至更高的阶段，开创更新的领域。
虽然如此，应用于临床作为病 理学的诊断还是少之又少，相信随着各种技术的提高，在不久的将来，将会有更多的荧光抗 体被应用于临床的诊断1) 常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有：① 异硫氰酸荧光黄(Fluoresein isothiocyanate，FITC)：结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄 色，易溶于水和酒精等溶剂，室温下可保存两年以上，最大发射光谱为520〜530nm，呈现 明亮的黄绿色荧光② 四甲基异硫氰酸罗达明(Tetramethylyodamine isothiocyanate, TRITC):结晶粉末状，呈紫 红色，易溶于水和酒精等溶剂最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光③ 四乙基罗达明(Tetramethylyodamine B200， RB200)：结晶粉末状，呈褐红色，易溶于酒 精和丙酮，但不溶于水最大发射光谱为596〜600nm,呈现橙红色荧光2) 常用的荧光标记法① 直接法：这是最早的方法其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗 体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光 显微镜下观察检查，作出判断评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体 的检测。
但其存在不足就是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前 较少作为更多方面的检测② 间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体， 与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物在荧光显微镜下，根据复合物的 发光情况来确定所检测的抗原评价：本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强， 因而其敏感性强目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一 抗体的标记显示1. 存在问题：2. 制作好的切片不能长期保存，影响各种资料的积累3. 所作出的结论较主观有些经固定的石蜡切片不适合等二)免疫酶细胞化学技术这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时， 抗原抗体复合物中带有标记结合上去的酶，其特性可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产 生不溶性的有色产物，从而可用一般光镜来检测判断，确定组织的来源、种属和部位 评价：1. 优点：2. 可用光镜检查3. 切片可长期保存，有利于资料积累4. 可以会诊，所得结果较为客观5. 既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片 技术较为简单，易于普及和推广。
1. 存在问题：2. 酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学3. 酶标记抗体分子量较大，对组织的穿透性较缓慢4. 抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响 阳性物的判断敏感性不强，目前已不被使用三） 非标记抗体酶法由于酶标抗体存在许多问题，1974年Strernberger等人建立了非标记抗体酶法，其 中最具代表的方法是过氧化物酶法即PAP[3]法奶头法的染色原理：应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体结合后的复合物与PAP复合物连接 起来，形成较大的复合物，利用复合物中HRP （）水解底物而呈色PAP由3个过氧化物酶分子和2个抗过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，较为稳定 评价：PAP法自建立起至二十世纪九十年代初期被应用，它在当时来说具有较高的敏感性， 有人认为它比酶桥法灵敏度高出20倍左右，有人则认为它的灵敏度与放射免疫法相似1. 存在问题：2. 第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物如第一抗为小鼠的，则第三抗体就一定要用 小鼠的3. 抗体孵育时间过长第一抗体的孵育时要求放于4°C冰箱中过夜，时间可达十几小时长 时间的孵育可产生几种不良后果：一是容易产生背景染色；二是影响染色的成功率，常可导 致切片脱离载玻片等。
4. 复合物分子较大，移动缓慢，对组织的渗透力不强5. 可产生背景染色，影响阳性结果6. 整个过程需时过长，约20小时阳性物不明显不突出四） 亲和组织化学法由于其它方法存在许多问题，1981年Hsu等⑸创立了美国广播公司法（抗生素 蛋白一维生素H—peroxidase复杂的技术），它的原理是利用卵白素分别连接生物素标记的 第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，于抗原抗体活性部位沉淀下来卵 白素是一种糖蛋白，在鸡蛋白中被发现，分子量为68000,它与生物素有4个连接部位据 认为卵白素和生物素的亲和力要比抗原和抗体的亲和力高出百万倍，因而它们能够牢固地结 合，又不影响它们间的生物活性评价：美国广播公司法自1981年创立至今已有二十多年的时间，在各种技术高 速发展的今天，这种技术能被较长时间的使用，说明它有着极强的生命力和实用性，这是因 为它有着以下主要特点：1. 敏感性强，卵白素与生物有4个连接部位，据认为它比PAP法敏感性更高，高出约20-40 倍2. 需时少，节省大量的时间如PAP法的一抗孵育时间于4C冰箱中需十几小时以上，而本 法一抗孵育时间在1-60分钟以内3. 背景清晰，阳性物鲜艳易辨。
4. 抗体可被高度稀释，增加标记病例，降低成本存在的问题：1. 需要预先形成复合物，即卵白素和生物素，在加于切片前的30分钟，先将两者混合起来， 形成复合物该复合物为三维结构，在结合了其它物质后，就会使自身体积增大，行动缓慢， 活动受限2. 卵白素中含有约7%的糖类，它可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景的染色3. 卵白素的等电点约10左右，可带较多的负电荷，纤维组织可带较多的正电荷，这两种 电荷可互相吸引，造成背景的染色4. 卵白素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，如此可降低 其敏感性五) 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP, Alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase)1984年Cordellt Massen氏等人创立了 APAAP法,该法的基本原理是在加入一抗后， 依靠二抗的桥作用，将抗原抗体复合物和APAAP复合物连接起来，然后通过复合物中的磷 酸酶对底物的水解，生成鲜红色或蓝色的产物鲜红色一般底物采用的是偶氮染料快红(fast red )或者蓝色快蓝色(fast blue)评价：在其它许多方法中，如ABC法和PAP法等，应用的显色剂都是3.3二氨基 联苯胺(3,3, diaminobenzidine, DAB),据认为，该试剂有致癌作用，(现已认为它已没有致 癌性作用)，为了避免使用上述试剂，因而创立了这种方法(它敏感性高，不受组织中内源 性过氧化物酶的影响和干扰，可产生出鲜艳的红色或蓝色阳性物，非常容易被鉴别，常被用 作双标。
存在问题：1. 切片不能长期保存因为显色用的是快红或快蓝，这些染料后着染色后的颜色，不能经 过酒精的脱水处理，一浸入酒精，所着染的颜色将被全部脱掉(只能用水性胶封片，然该种 封片法保存的切片时间不长，一般只有数月即会褪色2•切片的透明度较差，不到于拍摄极佳的照片六) 免疫金银法(Im munoglold-sliver staining, IGSS)1978年Geoghegan等首次应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原1981年 Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的IGSS基本原理：通过免疫反应，沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化作用，用对苯二酚将 银离子还原或银原子，被还原的银原子沉积在金颗粒周围形成“银克”它本身具有催化作用， 使更多的银离子还原并促进“银壳”越长越大，最终在光镜下就能看到被放大的黑褐色物质评价：该法敏感性高，特异性强，据认为它比PAP法高20倍左右[4],背景较低， 阳性物易辨性好，可用于任何切片，能检测微量的抗原存在问题：1. 操作繁锁，步骤较多2. 需要预先制备成胶体金3. 需要在暗室中进行4. 由于使用的金-银试剂，容易造成沉淀或污染。
七)LSAB 法，(Labeled streptavidin biotin)或者 SP 法(Streptavidin)ABC法虽然是一种很好的方法，但是在实际的应用过程中，确实也存在着许多问 题[5],为了解决和克服存在的问题，90年代初提出了用链卵蛋白素(streptavidin)替代ABC 法中的卵白素生物素复合物该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白，有四个和生物 素亲和力极高的结合点评价：LSAB法是目前国内使用最广泛的一种方法，由于它的敏感性强，效果好,背景清晰，无杂质而大受人们的欢迎其优点有：1. 不需预先形成复合物，分子体积小，行动灵活，对组织参透性强2. 链卵蛋白素的等电点为5.5-6.7,接近中性，所带的负电荷少，不容易与组织中的正电荷 发生相互吸引，因而可降低背景的染色3. 链卵蛋白素不含糖基，不存在与组织中含糖基类的物质起反应的现象4. 链卵蛋白素有4个与生物素结合的点，它们可以全部地和2抗上的生物素结合，从而增 加其敏感性，从某种意义上讲，它比ABC法的敏感性起码增加一倍以上5. 节省时间，每种抗体的孵育时间都在10-30分钟左右6. 抗体可以高度稀释，增加标记病例，降低成本。
7. 背景清晰，无非特异性染色，阳性物突出，明显易辨8. 染色时间短，提高了染色的成功率，经几千例的实验证明，染色成功率几近100%，减少 了反复制作的机会，保证了病理报告的及时发出，为病人的治疗和诊断赢得了时间八） EnVision TM Systems该法是近几年在国内推广使用的一种方法，它的原理是将多个抗鼠和抗兔诉IgG 分子与辣要过氧物酶聚合，当形成复合物后，可直接与抗原抗体的复合物聚合在一起，经 DAB显色即可完成染色评价：1. 该法敏感性更高，效果更好2. 步骤减少，省时省力3. 抗体的孵育时间可节省4•该系统不含有生物素，可以免除由内源性生物素所造成的背景染色5. 背景清晰干净，阳性物突出明显九） 真空负压LSAB法该法创立于1992年，几经实验证明，该法效果好，质量高，能节省很多时间，并 获得军队科技进步3等奖其基本原理是：各种物质的分子在真空负压的条件下，由于失重而飘游起来，从而增加了各物质分 子间的碰撞机会，加速了抗原抗体的结合，使反应提前完成特点：1. 省时，全过程由过去的十几小时缩短为1-1.5小时，为患者获得更多的时间2. 抗体可高度稀释，可达厂家推荐的稀释度高1-2倍，增加标记的病例，降低成本。
3. 不需要用酶消化，简化了步骤；保证了染色的成功率，减少了返工的现象，节省了人力 物力4. 全部过程不需加温，减少摸索温度的麻烦，条件易控制5. 不受其它条件的限制，每次可大量染片，多至百余张6•阳性反应物颜色鲜艳，色彩迷人，背景清晰，无非特异性染色，结果易判断。