分子标记技术,,姓 名：赵 淑 莉 学 校：吉林大学,,主要内容,,概 述,,致 谢,概 述,分子标记技术(Molecular Markers),1974年,Grozdicker 等人在鉴定温度敏感表型的腺 病毒DNA突变体时， 利用限制性内切酶酶解后得到 的DNA片段的差异，首创了DNA分子标记所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子 通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记 分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异类型及原理,现已出现的分子标记技术有几十种，部分分子标记技术所属类型如下： 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP )； 染色体原位杂交(CISH)以重复序列为基础的分子标记技术 卫星DNA (Satellite DNA ) ； 小卫星DNA ( Minisatellite DNA ) ； 简单序列重复SSR( Simple Sequence Repeat )，即微卫星DNA。
以PCR为基础的分子标记技术 随机扩增多态性DNA( RAPD )； 扩增片段长度多态性 (AFLP) ； 单链构象多态性(SSCP)； cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP )； 靶位区域扩增多态性(TRAP)； 序列特征化扩增区域(SCAR)； 相关序列扩增多态性(SRAP )以mRNA为基础的分子标记技术 表达序列标签(ESTs) ； 差异显示(DD) ； 逆转录PCR (RT-PCR) ； 差异显示逆转录PCR (DDRT-PCR) ； 特征性差异分析(RAD) ； 基因表达系列分析(SAGE) 以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术 单核苷酸多态性标记(SNP) 以特定序列为核心的分子标记技术 线粒体DNA分子标记(mtDNA),代表性分子标记技术的原理,限制性片段长度多态性(RFLP) 由Grozdicker创立，并于1980 年由Bostein 再次提出 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA， 就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上, 选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。
探针： 通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段其中cDNA 探针保守性较强，许多同科物种cDNA 探针都可以作为通用探针限制性片段长度多态性(RFLP),应用 在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、亲缘鉴定、物种分类和进化关系研究，以及组建高密度的遗传图谱和育种操作等方面都有一定的应用和重要的实用价值限制性片段长度多态性(RFLP),,限制性片段长度多态性(RFLP),优点 标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响 RFLP 标记的等位基因是共显性的，不受杂交的影响，可区分纯合基因与杂合基因 可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组缺点 标记技术需要酶切, 对DNA 质量要求高； RFLP 的多态性程度偏低； 分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境 都有害； 探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高限制性片段长度多态性(RFLP),染色体原位杂交(CISH),染色体原位杂交在原位杂交技术中应用最广泛，它是一种基于Southern 杂交的分子标记技术 原理： 该技术利用特异性核酸片段作探针, 直接同染色体DNA 片段杂交, 在染色体上显示特异DNA 。
染色体原位杂交(CISH),探针 可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射自显影显示杂交信号, 也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示 优点 准确、直观 缺点 技术非常复杂,,简单序列重复(SSR)即微卫星DNA 微卫星是指以少数几个核苷酸( 1 6 个) 为单位 多次串联重复的DNA序列 微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性简单序列重复(SSR),,原理： 由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性 根据其两端的保守序列设计一对特异性引物， PCR 扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性简单序列重复(SSR),,应用 是种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多样性、系统发生等研究领域简单序列重复(SSR),,优点 分布广泛、多态性丰富、杂合度高、通用性好以及扩增反应所需模板量少、重复性好，共显性遗传、检测方便、结果稳定。
缺点 增大了基因型错误判别的可能性简单序列重复(SSR),,随机扩增多态性DNA(RAPD),建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术原理： 1.利用一个随机引物( 一般为10个碱基) 通过PCR反 应非定点地扩增DNA片段； 2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分 离； 3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD 指纹； 4.进行DNA 多态性分析随机扩增多态性DNA(RAPD),,RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同，结合位点不同，扩增得到的DNA片段的区域不同 如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的插入、缺失等突变， 就可能导致这些特定结合位点、扩增片断发生相应的变化而使RAPD扩增产物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度发生相应变化从而可以检测出基因组DNA在这些区域的多态性随机扩增多态性DNA(RAPD),随机扩增多态性DNA(RAPD),,应用 RAPD技术广泛应用于天然居群内及居群间的遗传变异、种质资源搜集、品种鉴定、种间或属间遗传关系、遗传图谱构建、基因定位与分离等方面的研究优点： 技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度快；DNA用量少； 实验设备简单，不需DNA探针， 设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析； 不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析； 用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整个基因组，而且不需要同位素，安全性好。
随机扩增多态性DNA(RAPD),缺点：实验的稳定性和重复性差 显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降； RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差随机扩增多态性DNA(RAPD),AFLP 是1992年由荷兰Key gene公司的科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记方法扩增片段长度多态性(AFLP),,原理 1.基因组DNA经限制性内切酶双酶切后， 形成分子量大小不等的随机限制性片段； 2.将特定的双链接头连接在这些DNA片段的两端, 形成一个带接头的特异片段；,,扩增片段长度多态性(AFLP),3.通过接头序列和PCR引物3末端的选择性碱基的识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段； 4.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将特异的限制性片段分离开来； 5.然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA指纹的多态性应用 AFLP作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势 在医学、农业、林业、畜牧业、渔业等领域中得到了广泛的应用。
扩增片段长度多态性(AFLP),优点 高度特异性，实验周期短， 可信度高，检测速度快 缺点 技术过程复杂，实验成本较高， 且受专利保护扩增片段长度多态性(AFLP),SNP主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性也即SNP 是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化 主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换或颠换、以及单碱基的插入或缺失等单核苷酸多态性标记(SNP),单核苷酸多态性标记(SNP),,原理： SNP 与RFLP及SSR 标记的不同有2 个方面：其一，SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记； 其二，SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的DNA 芯片技术对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显示最终结果检测 DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis) ，可以高速度地检测临床样品的SNP 杂交型芯片将等位基因特异寡核苷酸共价固定在载体表面，用荧光标记引物扩增基因组DNA，再与芯片上的寡核苷酸杂交形成信号，并行读取芯片上不同SNP 荧光信号，获得SNP 信息。
单核苷酸多态性标记(SNP),应用 种群生物学特征、遗传性疾病检测、疾病关联分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因组作图和数量性状定位等方面也有越来越多的应用 优点 数量多，分布广泛，检测快速、 易于实现自动化，遗传稳定性高 缺点 成本高，错误信号多单核苷酸多态性标记(SNP),,ESTs( Expressed Sequence Tags)是在人类基因组计划实施过程中，由美国国立卫生研究院生物学家Venter J提出的发现基因的新战略 ESTs是指从cDNA文库中随机挑取克隆并对其3或5端进行单轮测序所获得的短cDNA序列，一般长度为300500bp表达序列标签标记技术(EST),,原理 由于ESTs是短的核苷酸序列，而且根据构建文库时所采用引物的差异，所测定的序列可以是cDNA的各个区段，包括5末端和3末端，以及5上游非翻译区( UTR)和3UTR，也可以是cDNA的任何内部序列因为cDNA来源于mRNA, 所以每一个EST均代表了文库构建原组织的基因组DNA中一个表达基因的部分转录片段表达序列标签标记技术(EST),数据库 目前常用的含有ESTs子数据库的有： NCBI的GenBank； 欧洲分子生物实验室的EMBL； 日本国家数据库DDBJ。
应用 构建遗传学图谱、分 离与鉴定新基因、 基因差异表达的研究、基因的定位克隆 用于制备cDNA芯片等表达序列标签标记技术(EST),优点 数量多，分布广泛，检测快速、 易于实现自动化，遗传稳定性高 缺点 获得的基因组信息不全，费用高， 对DNA质量和cDNA文库要求高表达序列标签标记技术(EST),相关序列扩增多态性(SRAP),,是基于PCR 技术的新型分子标记技术 原理 利用基因外显子里G、C含量丰富， 而启动子和内 含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放 读码框架进行扩增 应用 适合于不同作物的基因定位、基因克隆和遗传图谱 构建等,相关序列扩增多态性(SRAP),,优点 简便、稳定、容易得到选择条带序列，在基因组中分布均匀 缺点 一套SRA P标记引物并不能够对所有的生物都通用，仍需不断开发出适合不同生物的引物此外，SRAP标记是对开放读码框进行扩增，所以对基因相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少TRAP是由Hu和Vick于2003年建立起来的一种新型DNA分子标记技术 该技术是利用生物信息工具和表达序列标签数据库信息，产生目标候选基因区域的多态性标记。
靶位区域扩增多态性(TRAP),原理 1.它是以基因组DNA为模板，采用两个人工合成的长度为1620 bp的核苷酸的固定引物与随机引物； 2.利用设计好的引物，通过PCR方法对基因组DNA进行扩增；,,靶位区域扩增多态性(TRAP),,3.PCR产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行检测，然后通过放射自显影或银染技术观察不同的带型(即多态性)； 4.通过扩增产物的多态性来反映基因组相应区域( DNA) 的多态性，从而形成围绕侯选目标基因序列的多态性标记靶位区域扩增多态性(TRAP),,应用 植物的遗传图谱构建、重要性状基因标记、 种质资源的多样性研究、分子标记辅助育种 等 优点 操作简单，重复性好，效率高靶位区域扩增多态性(TRAP),多样性芯片技术(DArT),,Jaccoud等2001年开发的多样性微阵列技术是依赖芯片杂交技术来辨别不同基因组之间多态性的方法多样性芯片技术(DArT),原理 将不同样本的基因组DNA 等量混合后进行限制性内切酶消化， 酶切后的片段与接头连接， 用与接头对应的选择性引物扩增连接产物得到基因组代表性片段， 并通过一系列过程将该基因组代表固定到玻片上制备芯片， 待测样品DNA 采用文库构建相同的方法进行处理，不同样本基因组代表扩增产物分别标记不同颜色的荧光作为探针，而后混和对芯片进行杂交。
由于不同样本的基因组DNA 序列有差异，因而与芯片上同一点序列杂交的效率不一致，芯片上只有与探针DNA 互补的点才具有杂交信号， 通过扫描仪可识辨不同颜色杂交信号的强弱或有无来确定待检测样本的遗传差别， 在DArT 多样性分析中表现不同杂交信号强度或有无的点就是一个DArT 标记，即为基因组代表中的一个多态性片段，可作为新的DNA 标记用于其他的研究多样性芯片技术(DArT),应用 DArT 技术可用于基因组研究的许多方面，如遗传连锁图谱的构建、标记辅助育种、遗传多样性分析、遗传分类及进化的分析等 优点 高通量，低成本，可用于没有序列信息的任何物种，自动化，不需要凝胶电泳，标记的发现和检测是平行进行，稳定可靠，重复性好，受发育阶段时空表达和染色体倍性的影响很小 缺点 显性标记，不能区分纯/杂合型限制性内切酶位点标签(RAD),限制性内切酶位点标签是Miller等于2007 年开发的一类高通量标记，与海量平行测序技术偶联可实现极高的分析效率限制性内切酶位点标签(RAD),原理 1. 将基因组DNA进行限制性内切酶消化， 2. 连上含有PCR 扩增引物区、海量平行测序引物区和样品条码( barcode) 的接头， 3. 用氮吹法将基因组DNA 进一步打断成很短的片段，接上非磷酸化的接头， 4. 进行PCR 扩增获得两端分别有不同接头的片段， 5. 进行短片段海量平行测序获得不同样品、紧临限制性内切酶识别位点的序列用作本子标记。
6. 选择不同的内切酶可获得不同数目的RAD 标记，因此，标记数目几乎是无限的应用 定位突变及遗传作图 特点 高效、快速、低成本,谢 谢！,。