甘露寡糖纳米制剂的制备及抗病促生长作用研究

甘露寡糖纳米制剂的制备及抗病促生长作用研究摘 要 本实验目的是探究制备甘露寡糖的方法，研究与开发甘露寡糖脂质体纳米制剂，评价甘露寡糖脂质体纳米制剂对动物抗病促生长和增强免疫力的功效实验采用枯草芽孢杆菌诱生的β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉来制备甘露寡糖；选用不同的脂质体制备方法来制备甘露寡糖脂质体纳米制剂；观察了甘露寡糖脂质体纳米制剂对正常小鼠脾淋巴细胞体外增殖和血清中的免疫指标、免疫器官指数的影响；研究了甘露寡糖脂质体纳米制剂对鸡的生长发育和免疫功能的影响；研究了甘露寡糖脂质体纳米制剂对鸡白痢沙门氏菌的预防效果；观察了甘露寡糖脂质体纳米制剂对鸡球虫致病力的作用效果结果表明：枯草芽孢杆菌不是高产β-甘露聚糖酶的菌株，诱生出的β-甘露聚糖酶活性很低，不适合用于甘露寡糖的制备实验筛选出乙醇注入法来制备甘露寡糖脂质体纳米制剂，正交试验证明，制备100 mL甘露寡糖脂质体纳米制剂的最佳参数为大豆卵磷脂800 mg，胆固醇200 mg，无水乙醇8 mL，磷酸盐缓冲液的pH 7.5，甘露寡糖1000 mg，其包封率高达54.47%，粒径分布在200 nm左右甘露寡糖纳米制剂能够显著提高小鼠的胸腺指数，降低血清中IL-2的水平。

甘露寡糖脂质体纳米制剂能够提高感染沙门氏菌鸡的保护率，减少鸡的死亡率甘露寡糖纳米制剂能提高正常鸡的增重率，增加采食量甘露寡糖脂质体纳米制剂能降低感染鸡球虫鸡的盲肠病变值和卵囊值，但不宜作为抗球虫药应用结论：已成功制备出甘露寡糖脂质体纳米制剂，其性质稳定，粒径达到纳米级，它能调节动物机体的免疫功能，改善动物肠道微生态平衡，促进动物的生长发育，提高机体的抗病力关键词 甘露寡糖 脂质体 纳米制剂 STUDY ON PREPARATION OF MOS NANOPREPARATION AND ITS EFFECTS ON GROWTH AND RESISTANCE TO DISEASES ABSTRACTThe aim of this study is to investigate MOS preparation and develop MOS nano liposome preparation.The effects of MOS liposome nano formulations on growth, resistance to diseases and immune functions were observed.In this study, Bacillus subtilis was induced by the β-mannanase hydrolysis of konjac flour to produce the MOS; Different methods were used to prepare nano-MOS liposome preparation; The effects of MOS nano liposome preparation on normal murine spleen lymphocyte proliferation, serum immune parameters and indices of immune organs were investigated; The effects of the MOS nano liposome preparation on growth and immune function in chicken were evaluated; The action of the MOS nano liposome preparation against infection of Salmonella pullorum was observed; The effect of MOS nano liposome preparation on infection of Eimeria tenella was assessed.The results showed that Bacillus subtilis is not a high β-mannanase strain induced yield of β-mannanase activity, of which was very low and not suitable for the preparation of oligosaccharides. Screening experiments were carried out to find a suitable method prepare MOS nano liposome preparation, orthogonal test showed that ethanol injection was chosen to prepare the preparation.The parameters to produce 100 mL of nano liposome preparation as follows: 800 mg of soy lecithin, 200 mg cholesterol, 8 mL of anhydrous ethanol, 1000 mg of MOS, phosphate buffer pH 7.5. The encapsulation rate of MOS nano liposome preparation according to this conditions is 54.47% as well as 200 nm particle size distribution.MOS nano-formulations significantly increased the murine thymus index, decreased serum levels of IL-2. MOS nano liposome formulations promoted the protection against infection of Salmonella pullorum in chicken with a lower mortality than control group. MOS nano liposome preparation improved the growth rate in chicken due to increased feed intake. MOS nano liposome preparation reduced infection of Eimeria tenella in chicken.In conclusion, the MOS nano liposome formulations have been successfully developed.This preparation is stable and its particle size to nano-scale. MOS nano liposome preparation could modulate immune function in mice and chicken, improve animal intestinal micro-ecological balance, promote animal growth and improve resistance to disease in chicken.KEY WORDS mannan oligosaccharides, liposomes, MOS liposome nano preparation目 录第一章 文献综述 21.1 寡糖的概念、特点及分类 21.2寡糖的理化性质、功能和制备工艺 21.3 甘露寡糖 21.4 甘露寡糖的研究进展 21.5 脂质体 21.6 脂质体的分类 21.7 脂质体作为药物载体的优点 21.8 脂质体的制备方法 21.9 本研究的目的和意义 2第二章 甘露寡糖制备方法研究 22.1材料 22.1.1 药品与试剂 22.1.2 仪器设备 22.1.3 菌种 22.1.4 培养基 22.2 方法 22.2.1枯草芽孢杆菌产酶活性的观察 22.2.2 产酶培养基的选择 22.2.3 β-甘露聚糖酶活力测定 22.2.4 甘露寡糖的鉴定 2第三章 甘露寡糖纳米制剂的制备 23.1 材料 23.1.1 甘露寡糖 23.1.2 药品 23.1.3 仪器设备 23.1.4 试剂的配制 23.2 甘露寡糖脂质体纳米制剂的制备方法 23.2.1 逆相蒸发法 23.2.2 薄膜分散法 23.2.3 乙醇注入法 23.2.4 乙醚注入法 23.3 脂质体粒径的分析 23.4 甘露寡糖脂质体包封率的测定 23.4.1 超速离心法测定包封率 23.4.2 透析法测定包封率 23.5 结果及分析 23.5.1 甘露寡糖脂质体制备方法的选择 23.5.2 甘露寡糖脂质体粒径的分析 23.5.3 甘露寡糖脂质体包封率的分析 23.5.4 甘露寡糖脂质体稳定性的检查 23.6甘露寡糖脂质体纳米制剂制备工艺条件筛选 23.6.1 乙醇注入法制备甘露寡糖脂质体 23.6.2 透析法测定脂质体的包封率 23.6.3 实验方法 23.6.4 实验结果 23.6.5 结果分析 2第四章 甘露寡糖脂质体纳米制剂对正常小鼠免疫功能的影响 24.1 实验材料 24.1.1 实验动物 24.1.2 药品 24.1.3 试剂盒 24.1.4 主要试剂 24.1.5 仪器设备 24.2 实验动物分组与处理 24.3 检测方法 24.3.1 小鼠脾淋巴细胞体外增殖实验 24.3.2 小鼠血清免疫指标 24.3.3 免疫器官指数 24.4 结果 24.5 讨论 2第五章 甘露寡糖纳米制剂对鸡人工感染鸡白痢沙门氏菌 2的预防试验 25.1 实验材料 25.1.1 药品 25.1.2 实验动物 25.2 实验方法 25.2.1实验鸡分组和处置 25.2.2 饲养条件、临床观察与日常管理 25.2.3 细菌学检查 25.2.4 药效判定 25.3结果及分析 2第六章 甘露寡糖纳米制剂对鸡的生长发育和免疫功能的影响 26.1 实验材料 26.1.1 药品 26.1.2 试剂 26.1.3 试剂盒 26.1.4 疫苗 26.1.5 实验动物 26.2 方法 26.2.1 实验动物分组与处置 26.2.2 免疫程序 26.3 检测指标 26.3.1 饲料报酬的评价 26.3.2 免疫器官指数及NO、GSH、总抗氧化力的测定 26.3.3 鸡血浆和脾脏匀浆中NO含量的测定 26.3.4鸡脾脏匀浆中GSH的含量测定 26.3.5 总抗氧化力 26.3.6 血液中免疫球蛋白的测定 26.3.7 血液生理生化指标测定 26.4 数据处理及统计分析 26.5 结果 26.5.1 不同日龄阶段体重变化和饲料报酬情况 26.5.2 不同日龄阶段平均增重的变化 26.5.3 21日龄鸡血液生理生化指标 26.5.4 21日龄鸡免疫指标 26.5.5 35日龄鸡血液生理生化指标 26.5.6 35日龄鸡免疫指标 26.5.7 49日龄鸡血液生理生化指标 26.5.8 49日龄鸡免疫指标 26.6 讨论 2第七章 甘露寡糖脂质体纳米制剂对鸡球虫致病力的影响 27.1 材料 27.1.1 试验动物 27.1.2 药品 27.1.3 鸡球虫卵囊 27.1.4 饲料 27.2 试验鸡的分组及处理 27.3鸡球虫了卵囊的收集和感染 27.3.1 鸡球虫的复壮 27.3.2 鸡球虫卵囊的收集 27.3.3 鸡球虫卵囊的感染 27.4 临床观察 27.5 药效评价 27.5.1血便计分 27.5.2死亡率 27.5.3相对增重率 27.5.4病变记分 27.5.5盲肠病变值 27.5.6卵囊值 27.5.7 卵囊计数 27.5.8 判定标准 27.6 结果及分析 2结 论 2参考文献 2致 谢 2攻读学位期间发表的学术论文目录 268 甘露寡糖纳米制剂的制备及抗病促生长作用研究第一章 文献综述1.1 寡糖的概念、特点及分类寡糖（Oligosaccharides）又名低聚糖或寡聚糖，是由2～9个相同或不同分子的单糖（糖单位）或其衍生物单位通过糖苷键连接起来形成的（支链或直链）低聚合度糖[1] [2]。

寡糖的相对分子质量位于200 Da～2000 Da之间寡糖种类繁多，其中主要包括甘露寡糖、帕拉金糖、耦合果糖、乳糖、蔗糖、乳酮糖、木寡糖、麦芽糖和低聚的异麦芽糖、果糖、乳果糖、半乳糖、龙胆糖等等[3] [4] 寡糖通常可分为两种——非功能性寡糖和功能性寡糖，其中非功能性寡糖像蔗糖、麦芽糖等是可以被机体消化吸收的，因为在人体中可以产生消化它们的消化酶而功能性低聚糖(Functional oligosaccharides)（通常称为寡糖）不能被人或动物机体消化道吸收，它们拥有一些特殊的生理学功能，是一种有益于机体健康的化合物截止到目前，已经发现的功能性寡糖的种类已经达到1000种之多，在国际上研发成功的就有70余种之多[5]随着人们生活水平的提高，人们对食品安全要求的提高以及国家相关部门的重视，人类对寡糖的研究也在逐步地加强和深入在我国，工业化生产的功能性寡糖就有十几种但是相对于发达国家，国内厂家生产技术的落后，生产出的产品中功能性寡糖含量低、纯度不高目前市场上的大多数寡糖产品均是普通级别的低聚糖，含有许多果糖、蔗糖和葡萄糖等成分[6]因此，我国对寡糖的研究还仍处于起步阶段，低聚糖生产的产量、品类和质量还远远达不到国际水平。

在国外，尤其是在欧洲、日本和美国等西方国家，他们已经把功能性低聚糖的研发与应用摆在突出位置，不断探索新的功能性寡糖和扩大功能性寡糖的商品化生产1.2寡糖的理化性质、功能和制备工艺寡糖具有稳定性高、热值低、易溶于水、黏度大和安全无毒性等特点，其味微甜，在生理pH条件下性质很稳定但是，寡糖稳定性受酸碱度的影响较大例如，当温度高到120 ℃，pH值为7.0时其性质相当稳定但是，在70 ℃、pH=3的酸性条件下时，却极易分解变性作为饲料添加剂的寡糖其分子结构中的α-1,4糖苷键所占比例很少，然而，在人或动物机体中的消化酶类在消化寡糖等碳水化合物的时候，它们的作用位点是α-1,4糖苷键，除此之外的却很难被消化其他的糖苷键大部分不能被哺乳动物消化，而是进人消化道后段，因而这些寡糖被命名为非消化性寡糖进人大肠后部的非消化性寡糖可以被肠道的双歧杆菌、乳酸菌等微生物通过产生各种糖苷键的酶有选择性地分解利用相反，像大肠杆菌等病原菌却不能消化利用寡糖[7] 甘露聚糖（Mannan）是一种由甘露糖、葡萄糖等单糖残基以β-1,4-D-吡喃甘露糖苷键相互连接的线状多糖[8]广泛存在于椰子肉、豆科植物的种子、魔芋根茎、针叶树木质、咖啡豆中[9][10]。

在保健品、化妆品和医药等众多领域中都有应用[11][12]引人注目的是，高分子量的甘露聚糖分子降解为低分子物质（低聚糖）后，这些低聚糖的理化性质与生理功能都会有很多的改变周海燕[13]在文中描述，生产葡甘露寡糖的方法包括人工化学合成、天然原料提取、天然多聚糖的酶解或酸水解以及酶催化的糖基转移反应合成等王梅，刘兆辉，江丽华等[14]用土壤中分离的高活性的芽孢杆菌生产的β-甘露聚糖酶在最适条件（50 ℃，pH 7.0）下，能将角豆胶和魔芋葡甘露聚糖水解为甘露寡糖，而且水解率很高李剑芳等[15]通过培养黑曲霉（Aspergillus niger）菌株LW-1生产的β-甘露聚糖酶，能将魔芋胶水解为葡甘露低聚糖，生成的寡糖含量达100%张迎庆等[16]使用绿色木酶这种纤维素酶水解魔芋葡甘露聚糖在40 ℃ pH 5.0反应2个小时，水解生产的低聚糖相对分子量为5100 DaShimahara与Emis[17][18]研究表明，β-甘露聚糖酶水解槐豆胶和魔芋胶时，主要的作用位点是非还原端的第3、4个糖残基，其产物低聚糖以，M-M-M，M-M-M-M，G-M-M-G，G-M-M-M，G-G-M-M，G-G-G-G，G-M-G，G-M-M，M-G-M，G-G-M，G-G，G-M，M-M等的形式存在。

徐春梅等[19]探究了黑曲霉菌株E-56生产的β-甘露聚糖酶和水解魔芋葡甘露聚糖的生产工艺，确定50 ℃，酶量为120 U／g，魔芋胶浓度240 g/L，酶解8 h为最佳的水解条件水解所产生的低聚糖聚合度在1.8-1.9之间杨文博等[20]用地衣芽孢杆菌在40 ℃，酶液终浓度1 U/mL，水解2 h NK- 27生产β-甘露聚糖酶,可得到对双歧杆菌具有较强促生长作用的低聚糖1.3 甘露寡糖甘露寡糖又称甘露低聚糖（mannan oligosaccharides ，MOS），是甘露聚糖经过降解（酶法或化学方法等）生成的聚合度通常为2～9的低聚糖，它是由10个以下半乳糖、甘露糖与葡萄糖或甘露糖分子残基通过β-1,4、β-1,3或α-1,2、α-1,6或α-1,3糖苷键连接成[21][22][23][24]MOS在有机溶剂会有沉淀或结晶析出，极易溶于水等极性溶剂其甜度比蔗糖低，粘度随温度的上升而下降，当冷却后粘度又增加当pH位于1.5～3.0之间时粘度迅速增加，pH为3.0～9.0时其粘度相对稳定在饲料制粒或高温处理时，仍能保证甘露寡糖结构和性质不变[25]甘露寡糖拥有着独特的生理活性和功能性质，在饲料添加剂、医疗、药物、食品保健等领域有着极其广泛的应用。

甘露寡糖在自然界植物中分布很广，像田箐胶、魔芋胶和瓜儿豆胶含有较多的甘露寡糖另外，甘露寡糖也存在于多种微生物细胞壁里[26] Nakakuki等[27]发现，MOS能选择性地促进双歧杆菌增殖，调节肠道微生物菌群，降低胆固醇，改善血糖，促进矿物质吸收，抗龋齿等功效Loo等[28]研究表明，MOS可以延缓肿瘤生长，预防结肠癌的发生甘露寡糖有显著的降脂作用，为治疗糖尿病的辅助治疗产品[29][30]甘露寡糖在动物消化道中是不易被消化的一方面，作为饲料添加剂的低聚糖分子结构中的α-1,4糖苷键所占比例很小，而哺乳动物的内源性消化酶类主要作用于碳水化合物的α- 1,4糖苷键，对其他糖苷键的分解能力很小，所以在很大程度上MOS不能被哺乳动物消化利用，大部分进入消化道后段，因而这些功能性寡糖又称之为非消化性低聚糖(简称NDOS)NDOS进入大肠后，可以被肠道某些微生物(双歧杆菌、乳酸菌等)选择性的消化利用，促进这些细菌的生长繁殖，因为MOS是这些有益菌生长代谢的很好的营养物质这些微生物可产生分解各种糖苷键的酶，故能消化非消化性寡糖[31]动物机体的非免疫防御机制就是通过胃肠道的内源微生物群发挥作用的。

胃肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌等是维持肠道菌群微环境和动物机体健康非常重要的细菌许多研究表明，甘露寡糖具有抑制病原菌的繁殖，改善肠道菌群，增强免疫力等功效[32][33]甘露寡糖能抑制如大肠杆菌菌等一些致病菌生长它能够识别、黏附和排除病原微生物因为大多数病原菌表面均含有外源凝集素，正是这些凝集素能结合消化道肠壁上的低聚糖结构受体，促使细菌的黏附和繁殖甘露寡糖能和肠上皮低聚糖结构受体竞争性地结合病原菌，阻断附着—繁殖—致病的病原菌致病途径，关于甘露寡糖对肠道细菌的作用见表1-1表1-1 甘露寡糖对肠道细菌的作用[35][34]细菌分类抑制作用促进作用有益菌长双歧杆菌√德式乳杆菌√嗜酸乳杆菌√干酪乳杆菌√病原菌大肠杆菌√沙门氏肠炎杆菌√肉毒梭菌√鼠伤寒沙门氏菌√肉毒梭状芽孢杆菌√生腐梭状芽孢杆菌√主孢梭菌√粪链球菌√甘露寡糖抑制肠道微生物的生长（见图1-1）图1-1 中表示血凝素表面有一些特异性的糖原化合物，如果饲料中添加寡糖，有害的病原菌就会与寡糖结合而不与肠壁结合，这样，病原微生物还没有或产生很少有害物质就已经被排泄掉了Figure 1-1 This figure indicated that the hemagglutinin surface of some specific compounds, glycogen, and if dietary oligosaccharides, and oligosaccharides harmful pathogens will be combined with but not with the intestinal wall, so that no pathogenic microorganisms or Produces very little excretion of harmful substances has been lost.朗读显示对应的拉丁字符的拼音 字典可翻译 50 多种语言· Wie bitte?· ¿Cómo estás?· กาแฟ· Простите· nazdar!· mijn vriend· Pardon ??· Je parle un petit peu français.· Hjelp!· มีสีสัน· Wie heißen Sie?· बन्दर· Je ne sais pas !· Buongiorno Principessa!· παραλία· أحب كرة القدم· سلحفاة· ओह यार! · miracoloso· rouge· Es ist sehr interessant!· hoje está ensolarado· sư tử· आज मेरा जन्मदिन हैं.· děti· さようなら· 국수· Ich bin vierzig Jahre alt· Wie gehts?· escargots· haydi gidelim· La voiture· χρησμός· hello· Vær så snill· שמח(From Ewing W N and Cole D J A 1994 The living Gut,Dungannon, Northern Ireland,Context)在众多寡糖中，只有甘露寡糖能结合外源性病源菌，有研究表明其截取肠道病原菌的情况[36]见表1-2 。

表1-2 甘露寡糖对肠道病原菌的截取率情况细菌分类截取菌株数总菌株数截取率（%）摩干氏变形菌1111100.0沙门氏肠炎杆菌44100.0锯杆菌属1212100.0沙门氏鼠伤寒杆菌41330.8大肠杆菌5411845.8沙门氏伤寒杆菌4666.7产生单孢菌属51729.4柠檬酸转化杆菌属3636100.0肺炎杆菌151693.81.4 甘露寡糖的研究进展有许多学者针对甘露寡糖抗病促生长的作用进行了研究周映华等[37]在肉鸡饲料中添加Bio-MOS，血清IgA、IgM和IgG的水平分别提高15%左右，新城疫抗体效价提高了30％以上阎桂玲等[38]用不同剂量的啤酒酵母甘露寡糖添加于鸡饲料中，发现MOS能够明显减少沙门氏菌和大肠杆菌的生长，同时能够增加巨噬细胞的吞噬能力孟岩，张辉[39]将0.3%的甘露寡糖添加于1日龄肉鸡的日粮中，结果表明，添加甘露寡糖和对照组相比，可以改善鸡肠道粘膜的结构，使肠粘膜的吸收面积增大，也可以降低料肉比张红梅等[40]在研究认为，普通幼鲤的饲料中添加0.3％Bio-MOS（最佳添加剂量）能明显提高其生产性能周红丽[41]研究了在断奶仔猪日粮中添加0.1％的Bio-MOS，结果发现血清IgA和IgG水平提高50以上％。

李云兰[42]研究发现，甘露寡糖能提高幼鲤细菌免疫后的成活率，提高增强幼鲤机体的抗病力Yoshida等[43]证明了甘露寡糖能增加大西洋鲶鱼抵抗疾病的能力Newman[44]研究证实，甘露寡糖提高鲑鱼苗的成活率和对鲑气单胞菌的抗病力，表明日粮甘露寡糖可以提高小鼠盲肠内IgA和血清IgA的水平杨桂芹，李玲，宁志利等[45]在日粮中添加异麦芽寡糖，探讨其对肉鸡的免疫功能的作用，表明异麦芽寡糖增加肉鸡血清中免疫球蛋白水平，提高肉鸡的免疫器官指数Dvorak[46]在仔猪饲料中加入MOS可显著地减少腹泻，提高日增重和饲料转化率高树冬[47]等研究证明肉鸭日粮中添加MOS可提高日增重李启林等[48]用MOS替代抗生素观察其对肉鸡生产性能影响，发现甘露寡糖能替代抗生素降低肉鸡死亡率和料重比，提高日增重 总之，甘露寡糖是一种能促进肠道有益微生物生长和调节肠道菌群的营养调节剂，也是一种益生菌MOS可以被认为是一种安全、绿色无毒的添加剂，它常用于饲料工业，在饲料中添加MOS能保证动物的健康和促生长的功效因此MOS是一种已经被公认的、最有开发价值的抗生素替代品1.5 脂质体 脂质体纳米制剂是纳米生物学前沿领域中的一种高科技产品，脂质体（liposome）又称为液晶微囊或类脂小球，它是一种超微型球状定向药物载体，是一种靶向给药系统(targeting drug delivery system)的药物新剂型。

脂质体的脂质双分子层结构类似生物膜结构，所以有生物膜特有的功能和性质，所以又被称作人工生物膜（见图1-2）脂质体剂型具有靶向、缓释、低毒、低残留、对生物体无毒、无副作用等特点将磷脂和一些两性物质分散于水中就会形成一个个多层或单层的球状的小囊泡每一层都是脂质双分子层，每一层之间都有水相相隔在电镜下，多呈球形或椭圆形，直径在几百纳米到几十纳米之间它们既有疏水性又有亲水性也就是说，脂质体既可以包裹脂溶性的药物又能包裹水溶性的药物水溶性药物往往包裹在脂质体的囊泡结构的腔室之中，而脂溶性药物和两亲性药物却包裹在脂质双分子层内部或者亲脂基部位 图1-2 脂质体结构模式图Figure 1-2 Structure diagram of liposomes早在1965脂质体就由英国的Bangham等[49]人提出脂质和脂质混合物均作为制备脂质体的原材料，常用的磷脂包括大豆卵磷、脑磷脂等以及一些合成磷脂胆固醇（cholesterol）又称胆甾醇，也是一种构成脂质体的原材料，它在调节脂质双分子层的 “流动性”中发挥着重要的作用在处于相变温度以上时，胆固醇可使膜发生有序排列，从而减少膜的“流动性”在相变温度以下时，可减少磷脂膜的有序排列，增加流动性。

在制药领域，脂质体作为一种药物新剂型已经得到了较为广泛的应用，尤其是在抗癌药、抗菌药和抗寄生虫药等方面有着无比的优越性另外脂质体也应用于抗结核药、激素类药、酶、解毒剂和免疫激活剂等药物种类在兽药领域纳米脂质体新剂型也有一定的研究和进展[50] 常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体1.6 脂质体的分类根据结构的不同，脂质体一般分为多室脂质体和单室脂质体，其中，单室脂质体指仅有一层磷脂双分子层结构的囊泡含有多层双层的磷脂膜结构的称为多室脂质体（1 μm～5 μm）而单室脂质体又可分为小单室脂质体（大于200 nm）和大单室脂质体（200 nm～1000 nm）[51]1.7 脂质体作为药物载体的优点提高药物靶向性，提高药物疗效近年来，随着生物技术的不断发展，脂质体的制备工艺逐步完善，加之脂质体适合于生物体体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是脂质体作为药物载体，具有靶向性，从而减少药物剂量，降低毒性，减少副作用等因此，脂质体包裹药物已经越来越受到重视1）载药的靶向性，作为药物的载体，载药的靶向性是脂质体极为突出的特点[53]。

像一些抗癌作用的药物，要求药物必须在保证不伤害机体组织的同时又能选择性地抑制或者杀伤癌变细胞，这就要求药物有很高的靶向性，而脂质体正是拥有这种功能，它组装的药物制剂不仅能选择性地将药物输送到器官或组织的靶向病变部位，而且还能提高靶部位的有效药物浓度，提高药物作用时间，减少药物毒性和副作用，增强药效[54]在体内小型的纳米级脂质体可以躲过网状内皮系统识别和吞噬，减少与单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，MPS)的结合，减慢对脂质体的清除速率[55]一般的脂质体进入机体内后由网状内皮系统吞噬，从而激活机体的自身免疫系统，增加药物在肝、脾等部位的累积这样载有药物的脂质体就有可能降低药物的毒性，提高其治疗指数，也就是说可以减少药物的治疗剂量[56]2）保护药物，还有一些用脂质体包裹的药物，他们有挥发性、易被氧化和易变性等缺点，脂质体的双层磷脂膜可以很好的保护药物不受外界环境的影响，也就是说增加了药物的稳定性3）无毒，脂质体的组成材料有磷脂、胆固醇等，这些物质本身就是机体组织的组成成分，所以毒性很低，无免疫原性，对机体没有危害4）增加或改变药效，脂质体与细胞膜极为相似，使脂质体与细胞膜有较强的亲和性，可增加被包裹药物的能力，起到增强疗效的作用。

有时改变脂质体的电荷和粒径大小，能引起药物的动力学性质改变、控制药物在组织中的分布和降低血液中药物的清除另外，由于细胞膜和脂质体结构类似，亲和力很强，所以包裹有药物的脂质体可以透过细胞膜，增强药物的作用[57] [58] 1.8 脂质体的制备方法常用的制备脂质体的方法有以下几种（1）逆相蒸发法：水溶性药物一般采用此法是指将脂质先溶于氯仿、三氯甲烷等有机溶剂中，再与用缓冲液溶解的药物溶液共同水浴超声乳化，然后用旋转蒸发仪负压下除去有机溶剂得到脂质体[59]2）乙醇（乙醚）注入法：是将磷脂等膜材料先溶于无水乙醇中，在固定的温度下慢慢滴于正在搅拌的药物的水溶液中，继续搅拌让乙醇蒸去乙醇挥发殆尽，就会形成脂质体[60] [61] [62]3）薄膜法分散法：这是一种经典的脂质体制备方法，最终形成的脂质体大多数为多室脂质体，通过超声处理能够得到小单室脂质体[63] [64]4）复乳法[65]5）pH梯度法[66]6）熔融法、冷冻干燥法以及主动载药法等1.9 本研究的目的和意义近年来，动物的疾病已经开始向混合性感染和非典型的方向发展，虽然疫苗的应用解决了不少问题，但变异的病原血清型很大程度上限制了疫苗的应用。

同时，由于抗生素的滥用导致的动物产品中药物的残留也极大地危害着人类的健康另外，随着人们对健康要求不断提高以及药品的毒副作用渐渐地被人们了解，从天然药物（包括动物药、植物药和矿物药）中寻找更安全有效的饲料添加剂已经成为饲料药物添加剂发展方向 21世纪以来，绿色环保型饲料添加剂的开发研究和应用将会是养殖业发展的必由之路新型抗生素替代品——甘露寡糖脂质体纳米制剂的研究与开发将在动物养殖生产中发挥动物产品的优质安全、动物饲料的高效转化和有效减少动物发病等方面独特的功效用甘露寡糖脂质体纳米制剂这种天然药物高新制剂替代抗生素和化学药物饲料添加剂，可避免抗药性和药物残留对畜产品的污染，减少畜禽有害排泄物、蛋白质用量和氮污染该项目的研究方法选用和研究内容方面在国内外均具有先进性和前瞻性第二章 甘露寡糖制备方法研究β-甘露聚糖酶(β-mannanase)又称β-1,4-D-甘露聚糖水解酶，是一种胞外酶诱导酶，广泛存在于植物、细菌或真菌等生物体内，该酶可以水解葡甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等多聚糖，主要是切割β-1,4-D-甘露糖苷键β-甘露聚糖酶分子量介于22000 KDa～62000 KDa之间。

在培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或黑曲霉(Aspergillus niger)的培养基中加入少量含有甘露多糖成分的魔芋粉或槐豆胶时，就能诱生出较高水平酶本实验采用枯草芽孢杆菌生产β-甘露聚糖酶，同时用3，5-二硝基水杨酸试剂法测定（简称DNS法）其酶活力，再用制备出的酶水解魔芋精粉来制备甘露寡糖2.1材料2.1.1 药品与试剂药材：魔芋精粉（购于湖北襄樊惠普科技生化工程有限公司）；魔芋胶（购自重庆市魔芋研究所）；甘露寡糖（购自河南可以化工有限公司）试剂：硝酸钠（NaNO3）、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、氯化钾（KCl）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、氯化铵（NH4Cl）、氯化钠（NaCl）、琼脂、蛋白胨、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、刚果红、碘、碘化钾、D-甘露糖、3，5-二硝基水杨酸、磷酸二氢钾（KH2PO4）等均为国产分析纯试剂2.1.2 仪器设备UV-1800紫外（可见）光分光光度计(北京瑞丽分析仪器有限公司)；高速冷冻台式离心机（Sigma）；DELTA320 pH计（瑞士梅特勒-托利多集团）；AIR TECH 超净工作台(苏净集团安泰公司)； HH.W21 电热恒温水浴箱（北京长源实验设备厂）；HASUC 恒温摇床（上海和呈仪器制造有限公司）。

2.1.3 菌种枯草芽孢杆菌（广西大学动物科学技术学院药理实验室保存）2.1.4 培养基实验用的各种培养基均为实验室自制2.2 方法2.2.1枯草芽孢杆菌产酶活性的观察2.2.1.1 枯草芽孢杆菌的培养将实验室纯化保存的枯草芽孢杆菌在普通平板培养基中划线培养，置37 ℃培养箱中培养24小时，细菌生长良好置4 ℃度冰箱保存，备用(可存放1个月左右)2.2.1.2 几种培养基配方及配置培养基（1）：魔芋精粉1.0 g，NH4Cl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 0.05 g，琼脂1.5 g ，调节pH为7.2；培养基（2）：魔芋精粉1.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，琼脂1.5 g，pH到7.2； 培养基（3）： 魔芋粉 1.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 1.0 g，琼脂1.5 g调节 pH到7.2；培养基（4）： 魔芋粉1.5 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，琼脂1.5 g；按上述培养基配方准确称量各个配方中的药品，分别置于250 mL的三角烧瓶中，加蒸馏水搅拌并加热充分溶解后定容至50 mL，调节相应pH值后进行高压。

在超净工作台上将培养基倒入平皿之中，冷却后即为不同的培养基平皿然后放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，培养之后无细菌生长即可使用挑取平板培养基存放的枯草芽孢杆菌菌落，划线接种到各种培养基上培养，置37 ℃恒温箱培养24 h后进行观察2.2.1.3 水解圈的观察2.2.1.3.1培养基的染色培养基用以下两种方法进行染色，染色后进行水解圈的观察1）刚果红染色：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg/mL的刚果红溶液，染色10~15 min倒去刚果红溶液，加入适量的物质的量浓度为1 mol/L的NaCl溶液进行洗涤，15分钟后弃NaCl溶液，观察菌落周围出现的透明圈2）碘液染色：往平板中倒入适量的碘-碘化钾溶液，静置10 min后观察细菌菌落周围有无透明圈或水解圈2.2.1.3.2 结果及分析培养皿（1）细菌生长不良，刚果红染色后培养基被染成红色，水解圈不太明显碘液染色培养基被染成蓝色，且蓝色成块状分布因为培养基中魔芋溶解不良，出现白色块状培养皿（2）（3）（4）细菌生长旺盛刚果红染色，细菌生长的部位未被染成红色，菌落周围出现明显的半透明水解圈同样，用碘-碘化钾溶液染色有明显的水解圈。

经18小时培养的细菌加入0.1%刚果红染色后，用1 mol/L的NaCl冲洗，可见菌落范围呈半透明状，其他部位均被染成红色另一用碘染色后结果和上述一样，只是没接种细菌的地方全部被碘染成蓝色2.2.2 产酶培养基的选择培养基Ⅰ：魔芋粉 0. 25 g，蛋白胨0.25 g，NaCl 0.125 g，高压前调整pH为7.57培养基Ⅱ：魔芋粉 0. 25 g，蛋白胨0.25 g，MgSO4·7H2O 0.125 g，KCl 0.125 g，KH2PO4 0.0125 g，Na2HPO4 0.0125 g，FeSO4·7H2O 0.0005 g，高压前调整pH为7.25按照上述的量分别装入两个具棉塞的250 mL的三角烧瓶中，并加水定容到25 mL，高压接种细菌（采用麦氏比浊法控制细菌浓度为3×108 cfu/mL左右，接种量为1%）然后摇床培养（200 r/min）,分别于不同的时间无菌取适量的培养液于4 ℃离心8000 r/min，10 min，得到的为黄色的有一定黏度的透明上清液，测定酶活力2.2.3 β-甘露聚糖酶活力测定 2.2.3.1 标准曲线的绘制分别取标准l.0 mg/mL D-甘露糖溶液0 mL，0.02 mL，0.04 mL，0.06 mL，0.08 mL，0.1 mL，0.12 mL，0.14 mL，0.16 mL和0.l8 mL，置于10支10 mL具塞试管中，加入DNS试剂0.2 mL，混匀后置沸水浴中加热2 min，显色，以流水迅速冷却，用蒸馏水定容至2.5 mL，以1号空白液调零，在540 nm处测定OD值，绘制标准曲线，标准曲线见图2-1。

图2-1 β-甘露聚糖酶活力测定标准曲线Figure 2-1 β-mannanase activity assay standard curve2.2.3.2 β-甘露聚糖酶活力单位定义在上述反应条件下，每分钟由底物释放出相当于l mg D-甘露糖的还原糖所需酶量为1个酶活力单位(U)2.2.3.3 培养液中酶活力的测定取0.04 mL 0.5 % (w/v)魔芋粉(用pH 7.0，0.0l mol/L磷酸钠缓冲液配制)，于10 mL具塞试管A、B中，50 ℃预热5～10分钟，A管在0.04 mL底物中加0.0l mL适当浓度的酶液，50℃水浴准确反应15 min，立即在A、B管中加入DNS试剂0.2 mL，在B管中补加0.1 mL酶液，置沸水浴中煮沸2 min，显色，然后以流水迅速冷却，用蒸馏水定容至2.5 mL，以B空白液调零，在540 nm处测定吸光度OD值2.2.3.4 结果及分析由于培养基加的魔芋精粉在培养之前呈胶胨状，培养基Ⅰ呈黄色，培养基Ⅱ呈浅灰色略带粉红培养17小时后观察，黏度明显降低，待到24小时的时候，取出观察，培养基Ⅰ未变色，培养基Ⅱ变成浅黄色分别取两培养液适量，加碘后培养基Ⅰ没有变化，培养基Ⅱ则完全变成蓝黑色。

所以培养基Ⅱ中应还存在淀粉，其细菌生长也不好将培养液4 ℃离心8000 r/min，离心10 min，测酶活力两种培养基测定出的酶活力分别为0.08 U和0.12 U（见表2-1），两种培养基生产出的酶活力都比较低表2-1 不同培养基生产出的β-甘露聚糖酶酶活力的比较液体培养基OD540值酶活力培养基Ⅰ0.0080.08 U培养基Ⅱ0.0120.12 U生产出的β-甘露聚糖酶酶活力比较低的原因可能是实验所用的枯草芽孢杆菌不是高产β-甘露聚糖酶的菌株虽然对魔芋精粉和魔芋胶都有水解作用，但水解作用不强如果在一些特殊的条件下（比如紫外灯照射等）使其发生变异或者在自然界分离大量的菌株 ，然后进行筛选可能会找到合适的高产菌株2.2.4 甘露寡糖的鉴定2.2.4.1 试剂配制展开剂：准确量取正丁醇66 mL、吡啶44 mL和蒸馏水33 mL，调整比例为6：4：3（V/V）；苯胺-邻苯二甲酸显色剂：准确称取邻苯二甲酸0.4 g，加入25 mL水饱和的正丁醇，等充分溶解后加入苯胺0.225 mL即得酸水解液的配制：称取20 mg甘露寡糖置具塞试管中，加入1 mol/L硫酸2 mL，盖上盖子沸水浴6小时，冷却。

之后用硫酸钡中和pH到7～8，吸取上清液，2500 r/min离心10 min，取上清再次离心后分装到EP管中–20 ℃冷冻保存1% D-甘露糖溶液：准确称取20 mg D-甘露糖于一试管中，加入2 mL蒸馏水即得1% 葡萄糖溶液：准确称取20 mg 葡萄糖于一试管中，加入2 mL蒸馏水即得2.2.4.2 操作步骤在层析缸中倒入1 cm高的展开剂，将点样端滤纸距边缘3 ㎝处用铅笔平行划一道线，并标记点样的位置将所要点样的样品（D-甘露糖，甘露寡糖，葡萄糖）用毛细管进行点样，点样量为10 μL之后，将点样端滤纸垂直伸至展开剂液面以下，注意不要没过所画的横线，避免滤纸碰到层析缸的边缘，上面用细线吊挂，盖紧缸盖，让其自然展开待展开剂跑到上端时，取出，挂起晾干用显色剂苯胺-邻苯二甲酸显色剂喷雾于已干的滤纸表明，悬挂置室温晾干然后再将其放入105 ℃干燥箱烘5 min显色 2.2.4.3 纸层析结果图2-2 甘露寡糖纸层析图Figure 2-2 MOS paper chromatograms在纸层析显示（见图2-2），从左到右依次为葡萄糖，甘露寡糖，D-甘露糖，均显灰黄色斑点甘露糖位移最大，葡萄糖位移最小，甘露寡糖介于二者之间，结果甘露寡糖棕褐色显色斑位于甘露糖和葡萄糖之间，证明是由甘露糖和葡萄糖组成，初步鉴定为甘露寡糖。

第三章 甘露寡糖纳米制剂的制备脂质体纳米制剂的制备方法有很多，如逆向蒸发法、复乳法和注入法等为了筛选出最优的制备甘露寡糖脂质体纳米制剂方法和最佳制备工艺条件，本章实验分别考察了几种脂质体制备方法来制备甘露寡糖脂质体纳米制剂，结果：在众多脂质体制备方法当中筛选出乙醇注入法是比较适合的制备方法评价脂质体的指标也有许多，例如包封率、粒径大小、zeta电位、稳定性、体外释放度等在众多指标当中，包封率和粒径大小是本实验主要考察的指标因为这两个指标是影响甘露寡糖脂质体纳米制剂优劣的主要因素为此考察了这种脂质体制备方法制备的甘露寡糖脂质体纳米制剂的粒径大小、包封率及稳定性在测定粒径时，采用了激光纳米粒度分析仪对其粒径进行了评估测定包封率时，采用了高速离心法和透析法这两种方法对脂质体进行包封率的测定，并且对这两种方法进行了对比除此之外，还对脂质体的稳定性进行了比较和观察乙醇注入法制备脂质体的的过程中受很多因素的影响，比如磷脂和胆固醇的比例、加入乙醇的量、磷酸盐缓冲液的pH值、甘露寡糖的量和温度条件等最后通过正交试验以包封率为标准筛选出乙醇注入法制备甘露寡糖脂质体纳米制剂的最佳参数3.1 材料3.1.1 甘露寡糖购自河南省可以化工有限公司。

3.1.2 药品大豆卵磷脂一（Lecithin High Potency）天津市科密欧化学开发中心 BR；大豆卵磷脂二，青岛艾美瑞生物科技有限公司 食品级；胆固醇（cholesterol）国药集团化学试剂有限公司 分析纯；无水乙醇、苯酚、浓硫酸、乙醚、氯仿、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12 H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、葡萄糖、亚硫酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钾（K2HPO4）、酒石酸钾钠和3，5-二硝基水杨酸为国产分析纯试剂3.1.3 仪器设备RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV-1800紫外（可见）光分光光度计(北京瑞丽分析仪器有限公司)；高速冷冻台式离心机（美国 Sigma）；KQ—250型超声波清洗仪（昆山市超声波仪器有限公司）；漩涡振荡器（常州市华普达教学仪器有限公司）；GM-20 透视电子显微镜(日本 日立公司)； Zetasizer Nano S 激光纳米粒度分析仪（英国 Malvern instrument lid）；0.22 μm滤膜、0.45μm滤膜（上海半岛实业有限公司）、PHS-3C PH计（上海精密科学仪器有限公司）；HH-S2 数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；78-1 磁力加热搅拌机（常熟市华普达教学仪器有限公司）；85-20 控温磁力搅拌器（金坛市医疗仪器厂）；HH.W21 电热恒温水浴箱（北京长源实验设备厂）；DELTA320 pH计（瑞士梅特勒-托利多集团）；DNP-9162 型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；GYB 高压均质机（上海东华高压均质机厂）。

3.1.4 试剂的配制3,5-二硝基水杨酸试剂：分别称取3,5-二硝基水杨酸1 g、苯酚0.2 g、亚硫酸钠0.05 g、氢氧化钠1 g和酒石酸钾钠20 g，用100 mL蒸馏水将其溶解，配好后存放于棕色试剂瓶中，稳定1周后使用6% 苯酚溶液：称取5 g苯酚于一烧杯中，加入蒸馏水定容至50 mL即得[67] 0.01 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12 H2O）2.189 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.529 g，加蒸馏水定容至1000 mL即得[68] pH 7.5的磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）3.4 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液197.5 ml，然后将混合溶液用蒸馏水定容至500 mL，pH计调节其pH值至7.5pH 7.0的磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）3.4 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液145.5 mL，然后将混合溶液用蒸馏水定容至500 mL，pH计调节其pH值至7.0pH 6.5的磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）3.4 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液76 mL，然后将混合溶液用蒸馏水定容至500 mL，pH计调节其pH值至6.5。

pH 6.0的磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.17 g，磷酸氢二甲（K2HPO4）0.435 g，然后用蒸馏水定容至500 mL，用pH计调节其pH值至6.0方可 3.2 甘露寡糖脂质体纳米制剂的制备方法[69] [70] [71]3.2.1 逆相蒸发法精确称取大豆卵磷脂100 mg，胆固醇25 mg（两者。