石蜡包埋的基本步骤和注意事项第一部分石蜡包埋的基本步骤一、脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件此外， 脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混 合的液体一.常用的脱水剂1. 酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力 比较强，又能硬化组织但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作 用因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓 度，这样可以避免组织过度收缩第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的 细柔组织需要慢慢脱水，从50%酒精开始如眼球，组胚组织等大多数组织标本 则是从70%酒精开始，再经80%，95%以至无水酒精但是有时为了某种特殊 要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元 和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓 度酒精的脱水过程经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水 即可用AAF固定液固定的组织可直接置于95%酒精开始脱水用醇性固定剂（如 Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70%，80%，90%，95%，以至无水酒精的脱水程序，即 可达到脱水的要求但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体 的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95%酒精，两次100%酒精重复进行脱 水，以保证组织的水分脱净脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定 剂的不同而异如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组 织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长水分必须脱干净，脂肪必须溶去含 有铭酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意，脱水时 间应比为镀银的同类组织要短脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分 完全脱净一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织，脱水全过程仅需要数小时即可达 到完全脱水在各级浓度酒精内处理的最短时间分别减少到2—4小时也能获得 满意的结果如果组织脱水不尽，随后的透明，浸蜡都会受到影响，致使切片很难以 完成较差质量的切片，很容易造成在染色时脱片，这样的组织蜡块，因其含有一 定的水分，一经与空气接触即干燥而凹陷脱水不尽的组织是不能切出很好的切 片的外检标本的制作,目前都采用快速脱水的方法。
科研标本，教学标本的脱水时间比 较长,其目的在于更充分脱水，并适当加强了组织的硬度酒精脱水剂使用不宜太久，应适时更换新液当酒精混浊，变黄或酒精滴于水中出 现乳白色混浊时,说明酒精中溶解了过量的脂类，这种情况一出现，将会影响脱水， 则应及时更换各种浓度酒精的配制：切片室内应常备有70%,80%,85%等各种浓度的酒精配制时应以95%酒精作为 基液加水稀释，不要用无水酒精去配制，因无水酒精的价格较高，极不经济配制方法如下：1. 先将高浓度酒精注入量杯，其量同将要稀释酒精浓度数字相等2. 加入蒸馏水，致总量达到原酒精浓度的数字量例如：(一) 用95%酒精配制成70%酒精时：⑴取95%酒精70毫升；(2)加蒸馏水使达到95毫升；稀释后的酒精既为70%的酒精二) 用80%酒精配制成60%酒精时：⑴取80%酒精60毫升；(2)加蒸馏水使达到80毫升；稀释后的酒精既为浓度为60%的酒精.其余类推，其他的试剂的稀释也均可以参照 此方法进行配制2. 丙酮(Acetone)：可用作固定液，也是一种比较好的脱水剂脱水能力强、速度快, 可配制不同浓度进行脱水但一般情况下，多用在无水酒精的补充脱水丙酮脱水时间比酒精强，但容易使组织过度硬化,所以应适当掌握脱水时间。
3. 正丁醇(Y-Buty alcohol)：正丁醇脱水能力较酒精弱,可与水、酒精相混合，而且 也能溶解石蜡，因此正丁醇不仅可以替代酒精使组织脱水，还可以代替二甲苯使组 织透明平常在稀释时都与酒精按照一定比例配制使用，或将组织脱水至90%酒 精后移入正丁醇，正丁醇再脱水后可直接投入石蜡用正丁醇脱水,组织比较少引 起收缩和硬化等不良结果4.二氧乙环(Dioxan)：二氧乙环是一种有毒物质,易挥发(使用场所必须通风)，能同 水、酒精、二甲苯相混合并能溶解石蜡,是一种既可以脱水,也具有透明效果的液 体脱水一般可以70%开始,再经过90%至纯二氧乙环，然后浸入石蜡二氧乙环 脱水对组织无收缩和硬化等不良现象,对较硬的组织或易收缩的组织可使用二氧 乙环二. 组织的摇震为加快脱水进程可将标本放入各级酒精内借助机器或手工震摇，还可以加温促进 脱水即将标本装在塞紧的玻璃瓶置于包埋箱或温箱内，因液体受热产生的正压 可增加溶液的对流但热酒精会使组织过硬，并有爆裂危险，除急诊外，最好不 用此方法二、透明组织脱水后，还要经过一个浸蜡的媒剂透明过程目的是使石蜡渗透到组织中去， 达到包埋的支持作用常用的脱水剂如酒精等，不能溶解石蜡与之相混合，因此 必须使用一种既可以同酒精又能同石蜡相混合的媒剂，当组织脱水后，浸蜡之前 将组织投入这种媒剂中。
由于两剂能相混合，另一方面也由于这种媒剂比酒精比 重大，组织中的酒精就被该媒剂取代，待酒精完全被该媒剂完全取代后，组织即 成透明状态，因此我们长称这种媒剂为透明剂，在制片中的这一过程就称为透明 过程实质上透明仅是一种过程而非目的，其所以出现透明现象使因其折光系数 改变的缘故从组织的状态上看，由于组织经过媒剂的作用之后，其折射系数近 于组织蛋白的折射系数，从而显示出透明状态组织一旦呈现透明状态，也说明 脱水剂已被媒剂所取代透明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡透明剂透明剂很多，一般常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等1. 二甲苯：是最为常用的一种透明剂，它能与酒精，丙酮相混合，又是石蜡的 溶剂在透明过程中，组织继续发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用 迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，一般是达 到组织的透明为度，小块组织在半至一小时内透明为了不使组织过度硬化，苯 则是更好的一种透明剂，它较甲苯和二甲苯的作用稍缓，对组织收缩较少，不 易变脆但苯较二甲苯毒性大，挥发快，故应注意安全使用2. 氯仿：也是一种很好的媒剂，它的作用缓和组织在此液内过夜也不至于过 硬变脆，这一点较苯，二甲苯和甲苯优良。
但氯仿比重较大，折光率较小，不能 改变组织的折光率，组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象，所以组织要 比实际需要浸渍更长一些时间保证完全渗透和置换出酒精3. 香柏油：是研究处理细柔组织的最佳透明剂，因它的硬化作用极小，组织在 此液体内较长时间甚至几个月也可无妨过硬的组织脱水后，（如皮肤和致密纤 维组织）用香柏油透明，经此处理后的组织容易切片不过香柏油的浓度大，渗 透力弱，同石蜡混合不及其他透明剂效果好，故常规石蜡切片一般不用透明时间的长短因组织的大小而异例如脑组织和有血块的组织，就应该缩短在 二甲苯内留置时间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时 间，最好先投入酒精和透明剂等量混合液半小时，再入透明剂，并更换一次透明 剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要半小时至2――3小时脂肪组织由于其结构不同透明最快，但是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透 明剂取代，因脂肪组织本身折光率与透明剂（二甲苯）相近，所以应在透明剂中 多浸一段时间使脂肪组织尽可能为透明剂所溶解，才有利于石蜡的侵入透明过久是否会导致组织过度硬化变脆，这取决于脱水的彻底与否，如果组织脱 水完全彻底，则不会导致过度硬化和变脆，个别含胶样物质过多的组织例外。
三、浸蜡组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙， 取代透明剂，这一程序就叫浸蜡根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于54 ―60.C温箱内进行石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关，因此对石蜡的选择 应以注意用作浸蜡的石蜡不应含有尘粒，杂质及其他异物，不含水分，质地均匀成半透明 状，触之感觉滑而不腻，结晶及颗粒少石蜡中如有水分会结晶而变为白斑可用 加热搅拌的方法除去所有的蜡在使用前按常规必须用标准滤纸在漏斗内过滤到 搪瓷杯里储存于浸蜡箱中最好将石蜡于小锅中加热煮至近沸，冷却再煮反复数 次后空气可以排除，挥发性油脂类在煮的过程中挥发处置后的石蜡置于恒温箱 中保持液体状态备用所用的石蜡有一定的熔点和硬度，熔点高，硬度大一般 要求在52—56°C之间，这既可以支持硬组织也可使切片成条使用时应根据组 织类型以及制片时的温度和气候而异夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔 点的石蜡石蜡的熔点越低，其质地相应的较为疏松硬蜡（熔点60C）用于硬纤维组织 软蜡用于胎儿和乳腺组织，这些尽为研究工作的需要为了增加石蜡的韧性，可 在石蜡中加入一些混合剂，常用蜂蜡，硬脂酸，松香等1. 蜂蜡：又叫黄蜡，是蜜蜂用来造巢的淡黄色蜡，熔点在54C左右，质地柔软， 滑润有韧性。
为了使低熔点的石蜡硬一些，可加入10—20%的蜂蜡它能增加蜡 的熔点而不必使组织浸在高温内，便于切片也要根据组织的种类而异，一般常 规用量不超过5%为度2. 硬脂酸：为有光泽的白色片状结晶体，不溶于水，而溶于乙醇，醚和氯仿熔 点64—71%，在浸蜡中加入少量的硬脂酸可增加石蜡的渗透性有人用硬脂酸 和石蜡混合液置于温箱中代替二甲苯透明3. 松香：为棕黄色半透明的固体质硬而脆，遇热熔解，呈胶体状，同石蜡混合 时，可增加石蜡的硬度，由于松香质脆，混合后可增加硬度但韧性不足组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异在整个浸蜡过程中，标本大 小对完成浸蜡所需的时间有很大影响较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中 心，而且厚的组织常带入的透明剂比较多，故需要多次浸蜡才能将透明剂除去 即使少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶，致使切片时切片易碎裂也要考虑组 织的种类，骨，皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍时 间含血多的组织，肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆，故浸蜡时间应缩短疏 松组织，脂肪，消化道组织等浸蜡时间可以适当延长一些为了尽可能排除透明 剂，浸蜡可以分两级或三级进行以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为 熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。
浸蜡时间1—4小时，或更长，并使之过 夜则较易切割，如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和龟裂四、包埋包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入 充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这 个程序称为包埋包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切 片一）石蜡包埋法石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌 握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种手工包埋的步骤如下：1. 组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内从恒温箱取出置于三角 架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态2. 准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持 蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内3. 迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保 证不再有气泡4. 待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至 蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5. 蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储 藏备用二)石蜡包埋程序1.组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小 时在实际操作中，各级酒精脱水的时间可以因组织的大小，多少而减少或延长， 如要在酒精中过夜最好是在低浓度酒精中浸泡，透明过程一定适当掌握，不要时 间过长更换脱水酒精，如从节约的角度考虑，可将各级酒精逐级下降使用，如 无水酒精可降为95%酒精在继续使用应考虑到组织在酒精中脱水过程里，除 去组织中的水分混入酒精，使其浓度降低外，组织中的一些可溶物质，如脂类也 可被酒精溶解，酒精中含有一定这样的物质时，将会降低脱水功效，因此，最好 是更换酒精组织脱水，透明彻底后，浸蜡过程在必要时候可以延长，例如，在石蜡中过夜， 但温箱一定要恒温，以免组织块受高温影响，造成组织过度硬化四.快速石蜡包埋法快速切片诊断是在数十分中或半小时左右制成切片并作出诊断的一种手段，主要 用于手术中决定手术的切除范围和手术方式快速切片的方法包括冰冻切片和快 速石蜡切片制作快速石蜡切片时，切取组织应该薄小，从固定、脱水到浸蜡的全过程都要加 温，一般是先将各种试剂在超声波快速石蜡脱水仪中预热，恒温下操作，整个过 程大约在10-15分钟即可完成。
操作过程：(1) 先取病变组织于AAF中固定3-5分钟2) 95%酒精1分钟3) 无水酒精1分钟(4) 正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分钟(5) 二甲苯1分钟(6) 浸蜡1—2分钟(7) 包埋，将组织置于预先备置的蜡块中(固体石蜡包埋法)；预备一硬蜡块， 用热镊子于蜡块中间熔蜡一小部分，在以热镊子从蜡杯内取出已与石蜡饱和之组 织块投入融蜡中，冷固后，立即进行石蜡切片石蜡切片附贴后，在火上稍加烘 烤使组织切片上石蜡全部熔化，水分也被烘干，然后投入二甲苯，100%酒精， 95%酒精各30秒脱蜡，入水冲洗，常规苏木素，伊红染色第二部分石蜡包埋的注意事项一、石蜡包埋的注意事项1. 作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬 度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以 硬度较低的石蜡包埋其熔点一般要求再602. 包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏， 使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断另 外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织 与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。
3. 包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宣4. 包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况 下可用镊子轻压5. 囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷 曲6. 相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片7. 多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成 直线或方块行，这样有利于切片8. 石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水 中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度但冷凝过速也会因为内外温差过大造 成蜡块裂损。