微生物检验59955ppt课件一、生理生化试验的概念及其类型一、生理生化试验的概念及其类型（一）定义（一）定义 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验属种的试验二）设计原则（二）设计原则 在试验中加入某些在试验中加入某些 化学物化学物 质，使细菌代谢质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入的化途径中分解代谢产物与加入的化 学物质发生反应，学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征产生某些变化或出现某种特征五）生理生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物培养、待检菌应是新鲜培养物培养1824h2、待检菌应是纯种培养物待检菌应是纯种培养物3、遵守观察反应的时间观察结果的时间，多、遵守观察反应的时间观察结果的时间，多为为24或或48小时4、应做必要的对照试验、应做必要的对照试验5、提高阳性检出率，至少挑取、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌待检的疑似菌落分别进行试验落分别进行试验一）过氧化氢酶及过氧化物酶试验原理一）过氧化氢酶及过氧化物酶试验原理 1、2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 阳性：气体产生 2、过氧化物酶：RH2+H2O2 过氧化物酶 R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色；阴性：不变色。
二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阳性阴性（二）细胞色素氧化酶试验原理（二）细胞色素氧化酶试验原理细胞色素细胞色素C 细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素氧化型细胞色素C+对苯二胺对苯二胺+-奈酚奈酚 靛酚兰（蓝色）靛酚兰（蓝色）阳性：阳性：2分钟内生成蓝色为阳性分钟内生成蓝色为阳性 阴性：无变化阴性：无变化阳性阴性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阳性：不抑菌，变混浊 阴性：抑菌（三）氰化钾试验（三）氰化钾试验二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 （四）硝酸盐还原试验原理（四）硝酸盐还原试验原理KNO3 还原酶 KNO2KNO2+对氨基苯磺酸+-萘胺 红色化合物（立刻或数分钟内）（五）糖发酵试验（五）糖发酵试验 分解糖产酸，PH值下降，使培养基的酸碱指示剂发生变化阳性：产酸产气阴性阳性阴性阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 （六）氧化发酵试验（六）氧化发酵试验（O/F试验试验）有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细菌称为氧化型；有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型；有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型阳性阴性灭菌琼脂（厌氧）二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 （七）甲基红（七）甲基红（MR）试验和）试验和V-P试验试验1、MR试验原理：试验原理：一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的和琥珀酸而使培养基的PH值下降到值下降到4.5以以下，加入甲基红指示剂出现红色反应下，加入甲基红指示剂出现红色反应2、V-P试验原理试验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。
精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物试验结果同（试验结果同MR试验）试验）阴性阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 （八（八）柠檬酸盐（枸橼酸盐）试验）柠檬酸盐（枸橼酸盐）试验 一些微生物可以以铵盐作为唯一的一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色指示剂变色九）丙二酸钠试验（九）丙二酸钠试验 一些微生物可以以丙二酸钠作为唯一些微生物可以以丙二酸钠作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色培养基变成碱性，酸碱指示剂变色阴性阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阴性阳性（十）马尿酸盐试验（十）马尿酸盐试验 一些细菌可以水解马尿酸生成一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反反应生成有色的苯甲酸盐沉淀应生成有色的苯甲酸盐沉淀十一）葡萄糖铵试验（十一）葡萄糖铵试验 有些细菌可利用铵盐作为唯一有些细菌可利用铵盐作为唯一氮源，并分解葡萄糖产酸，酸碱指氮源，并分解葡萄糖产酸，酸碱指示剂变色，培养基变黄示剂变色，培养基变黄阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阳性阴性（十二）明胶液化试验（十二）明胶液化试验 一些细菌可产生胞外酶，使一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明而失去明胶的凝固能力。
胶的凝固能力十三）苯丙氨酸脱氨酶试验（十三）苯丙氨酸脱氨酶试验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶，一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶，可以脱氨可以脱氨 生成苯丙酮酸，其与生成苯丙酮酸，其与FeCl3反应产生绿色反应产生绿色二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阳性阴性阳性阴性（十四）氨基酸脱羧酶试验十四）氨基酸脱羧酶试验 一些细菌可以产生氨基酸脱羧酶一些细菌可以产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧，使氨基酸脱羧，产生胺类物质，使培养基变碱，酸产生胺类物质，使培养基变碱，酸碱指示剂变色碱指示剂变色十五）尿素试验（十五）尿素试验 一些细菌可以产生尿素酶，使尿一些细菌可以产生尿素酶，使尿素分解产生大量的氨，使培养基素分解产生大量的氨，使培养基变碱，培养基指示剂变色变碱，培养基指示剂变色阳性阴性阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阴性对照（十六）靛基质试验（吲哚试验）（十六）靛基质试验（吲哚试验）一些细菌可以分解蛋白胨的色氨一些细菌可以分解蛋白胨的色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色十七（十七）ONPG试验（试验（检测检测-半乳半乳糖苷酶）糖苷酶）邻硝基酚邻硝基酚-D半乳糖苷半乳糖苷 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 邻硝基酚邻硝基酚+-D半乳糖半乳糖 阳性对照阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阴性（十八）淀粉酶试验（十八）淀粉酶试验 一些细菌可产生淀粉酶将淀粉一些细菌可产生淀粉酶将淀粉分解为双糖或单糖，加入碘不变色。
分解为双糖或单糖，加入碘不变色十九）卵磷脂酶试验（十九）卵磷脂酶试验 一些细菌产生卵磷脂酶，可以一些细菌产生卵磷脂酶，可以分解卵磷脂产生甘油脂和水溶性的分解卵磷脂产生甘油脂和水溶性的磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色的沉淀或浑浊带白色的沉淀或浑浊带接种菌，可产生淀粉酶透明圈乳白色浑浊带二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 （十九）脱氢酶试验（十九）脱氢酶试验 微生物有脱氢酶，可使氯化三苯四氮唑（TTC)还原，由无色变为红色二十）硫化氢试验（二十）硫化氢试验 一些微生物分解含硫氨基酸（胱氨酸或半胱氨酸），产生硫化氢硫化氢与二价铁盐或铅盐生成黑色沉淀，使培养基变黑阳性二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 （二十一）动力学试验 有鞭毛的细菌在半固体培养基中除了沿穿刺线生长外，在穿刺线周围可见到羽毛状或云雾状浑浊生长二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 阳性阴性（二十二）（二十二）三糖铁试验三糖铁试验1、培养基主要成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源）三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1%硫酸亚铁 琼脂 培养基摆成高层斜面 pH值调到7.4 黄 pH72、接种（1）斜面划线接种 （2）穿刺接种36oC培养18-24小时二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 3、观察结果（1）乳糖、蔗糖中，至少分解其中的一种，则：斜面：产酸显黄色（阳性）底层：产酸显黄色（阳性）（2）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖，则：斜面：产碱显红色 （阴性）底层：产酸显黄色 （阳性）（3）三种糖均不能分解，则：斜面：产碱显红色 （阴性）底层：产碱显红色 （阴性）（4）分解含硫氨基酸 产硫化氢，则 硫化氢与Fe 2+生成黑色沉淀（FeS），培养基变黑（5）分解糖类产气，培养基中有气泡。
二、常见生理生化试验二、常见生理生化试验 一、定义一、定义（一）定义（一）定义 菌落总数（菌落总数（aerobic plate count）是指食品检样经过处理，）是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得需氧性质等），所得1g（或（或1mL）检样中形成菌落的总数检样中形成菌落的总数实际上只包括在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌实际上只包括在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌或兼性厌氧菌二）卫生意义（二）卫生意义1.可作为判定食品被污染程度的标志；可作为判定食品被污染程度的标志；2.可用来观察细菌在食品中繁殖的动态；可用来观察细菌在食品中繁殖的动态；3.为食品进行卫生学评价提供依据为食品进行卫生学评价提供依据第一节 菌落总数测定二、原理二、原理 样品经稀释后，使样品悬液中的微生物分散存在，样品经稀释后，使样品悬液中的微生物分散存在，接种一定量到培养基中，充分混匀从理论上来说微生接种一定量到培养基中，充分混匀从理论上来说微生物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落，计算菌落数可推出菌体数。
可见的菌落，计算菌落数可推出菌体数第一节 菌落总数测定五、稀释度选择方法五、稀释度选择方法（一）根据食品卫生标准选择（一）根据食品卫生标准选择1.1.使平板上菌落数落为使平板上菌落数落为3030300cfu300cfu；2.2.若落不到若落不到3030300cfu300cfu，尽量接近，尽量接近30cfu30cfu或或300cfu300cfu；3.3.使平板上菌落数宁多不少使平板上菌落数宁多不少（二）根据对样品污染程度的估计（二）根据对样品污染程度的估计第一节 菌落总数测定六、菌落总数测定时的注意事项六、菌落总数测定时的注意事项：1 1、固体样品应彻底粉碎；、固体样品应彻底粉碎；2 2、培养基（营养）琼脂必须透明、无杂质；、培养基（营养）琼脂必须透明、无杂质；3 3、选择好稀释度；、选择好稀释度；4 4、培养基温度应在、培养基温度应在4646o oC C，不能过烫，否则易把细菌，不能过烫，否则易把细菌烫死；烫死；5 5、培养液中接种菌悬液后，应在、培养液中接种菌悬液后，应在20min20min内接种培养基，内接种培养基，（时间太长，某些细菌可自动凝集）培养基和菌悬液必（时间太长，某些细菌可自动凝集）培养基和菌悬液必须充分浑匀。
须充分浑匀第一节 菌落总数测定第二节 大肠菌群计数一、定义一、定义 大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在3636o oC C 条件下培养条件下培养48h48h能发酵乳能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义食品食品（目前大多数国标规定）（目前大多数国标规定）中大肠菌群数系以每中大肠菌群数系以每100100毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（MPNMPN）表示二、选择粪便污染指标菌应具备的条件二、选择粪便污染指标菌应具备的条件 1、这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多；、这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多；2、在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长；、在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长；3、在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和、在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和食品中不能发现；食品中不能发现；4、对氯的低抗力与肠道致病菌相似；、对氯的低抗力与肠道致病菌相似；5、检验方法比较简单，易于检出。
检验方法比较简单，易于检出第二节 大肠菌群数测定三三、大肠菌群数测定的卫生学意义：、大肠菌群数测定的卫生学意义：大肠菌群包括：艾希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、大肠菌群包括：艾希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属克雷伯氏菌属新鲜粪便中艾希氏菌属占优势新鲜粪便中艾希氏菌属占优势1、大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又、大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又包括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全包括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全保险系数更大了；保险系数更大了；2、测定大肠菌群含量表明食品、饮料被粪便污染的程、测定大肠菌群含量表明食品、饮料被粪便污染的程度：如果菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间度：如果菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间接表示有肠道致病菌污染的可能性接表示有肠道致病菌污染的可能性第二节 大肠菌群数测定四、大肠菌群数四、大肠菌群数测定原理测定原理二步九管法二步九管法1.初发酵初发酵培养基：月桂基硫培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨酸盐胰蛋白胨2复发酵复发酵培养基：煌绿乳糖培养基：煌绿乳糖胆盐胆盐培养时间：培养时间：48h第二节 大肠菌群数测定结果处理现有国家标准的稀释度选择方法现有国家标准的稀释度选择方法设设E为国家标准规定的待检食品大肠菌群指标为国家标准规定的待检食品大肠菌群指标1.待检食品为液体食品，待检食品为液体食品，如如E3，加样方法为：，加样方法为：原液各原液各10mL分别接种到分别接种到3管双料管双料LST中，原液各中，原液各1mL分别接种到分别接种到3管单料管单料LST中，中，10-1稀释液各稀释液各1mL分别分别接种到接种到3管单料管单料LST中；中；2.其他所有食品的加样方法为：其他所有食品的加样方法为：10-1稀释液各稀释液各10mL分别接种到分别接种到3管双料管双料LST中，中，10-1稀释液各稀释液各1mL分别接种到分别接种到3管单料管单料LST中，中，10-2稀释液稀释液各各1mL分别接种到分别接种到3管单料管单料LST中；中；根据大肠菌群阳性管数根据大肠菌群阳性管数,查查MPN检索表，报告每检索表，报告每 g(mL)样品中样品中大肠菌群的大肠菌群的MPN值值。
经过和标准起草人沟通，此方法标准的单位可以乘以经过和标准起草人沟通，此方法标准的单位可以乘以100，最，最终报出终报出MPN/100g(100mL)现国标的现国标的MPN表与原国标的表与原国标的MPN表的不同点：表的不同点：1，现表里的数字是有小数点的，而原标准对小数点进行了，现表里的数字是有小数点的，而原标准对小数点进行了四舍五入的处理四舍五入的处理2，现标准的，现标准的MPN表比原标准的表比原标准的MPN表要简化一些原标准表要简化一些原标准MPN表有表有64个组合，而现标准个组合，而现标准MPN表只有表只有40个组合3，报告单位不同现报告单位为，报告单位不同现报告单位为MPN/g(mL)，而原报告单，而原报告单位是位是MPN/100g(100mL)总结：提高大肠菌群检出率的措施：总结：提高大肠菌群检出率的措施：1、小于、小于30的液体样品，取原液的液体样品，取原液10ml、1ml和和1：10稀释液稀释液1ml接种2、若小管中无气泡应轻轻振摇试管，若有气泡、若小管中无气泡应轻轻振摇试管，若有气泡上升也算产气上升也算产气第二节 大肠菌群数测定。