浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班技术资料胡东维 洪 健 徐 颖浙江大学2001 年 10 月浙江大学胶体金免疫标记培训班资料一、胶体金的制备根据不同的制备方法，可以制备出直径 1-500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在 3-3 0nm范围内在氯化金（HAuCl 4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子 使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小即粒子大小 取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量还原剂浓度越高，核浓度也 越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量 越多，但体积也越小粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的 1/8以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径 3〜16nm的胶体金因此一般胶体金探针均使用该方法进行但该方法制备的胶体金粒子 直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合 此时在溶液中添加0.1〜0.2%的H2O2能够去除这些残基双标记或制备5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法利用柠檬酸为还原剂，可以制备12〜150 nm直径的胶体金。
但制备大体积 的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加因此做单标记时，建议使用该方 法制备12-16 nm直径的胶体金除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5nm的胶体金，它避免了 单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大磷易燃且有毒，制备的 残液需进一步处理，故该方法已经很少使用氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯 化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20C） 注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗， 有条件时可硅化处理（1 %双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用 0.22 m微孔滤膜过滤后使用三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存， 以防污染制备好的胶体金保存寿命较长，可4 °C保存6个月以上或室温下保存1-2个 月当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用但无论无何，在保存较长时 间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3〜16 nm胶体金（1）取一 250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1 %氯化金，预热至60〜70°C。
⑵取一 50 ml烧杯，加入4 ml 1 %柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积 大小加入不同用量的单宁酸及等量的 25 mM K2CO3预热至60〜70CK2CO3的作用是保持溶液的中性pH因此如果单宁酸的量少于0.5 ml 时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略3）将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温 10分钟自然冷去卩柠檬酸钠（ml）单宁酸（l）胶体金（nm）450003420004450064120847010410162、白磷还原法制备5 nm胶体金⑴ 取250 ml三角瓶一个，加79 ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3将溶液调至中性（PH7.0）⑵ 取0.2 ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中，再加0.8 ml乙醚，混匀 取0.7 ml加入溶液（1）中（磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶 液用CuSO4进行中和）3）室温下轻轻摇匀15 min，然后加热沸腾并保持5 min，自然冷却3、柠檬酸三钠法制备12-30 nm胶体金（Fre ns, 1973）（1）取250卯1三角瓶一个，加100 ml双蒸水及1 ml 1%氯化金，加热沸腾;⑵取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。
混匀，再保持沸腾 30 min，柠檬酸钠（ml） 胶体金（nm）溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而 粒子体积较大020 40 BD 30Sol diameter mm)1216注意：（1） 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差， 以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备 完成后必须进行镜检如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘 不清晰等问题，须重新制备2） 胶体金溶液最好保存在4 C冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2 个月但决不可保存在0C以下，否则金粒子发生凝聚二、蛋白-金复合体的制备一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这 种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子， 以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起胶体金粒子对蛋白的吸附作用取 决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的 pH值，在pH=pl时为中性 由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏 水的金粒子表面但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。
胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐 分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝 聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行2）使蛋白分子尽量分散为单体， 冻干蛋白或咼浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多 个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析 （3）使蛋白具有适当的分子量蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间 内失活而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构 与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长 探针寿命（防止凝集）的有效办法把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA， 牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH值对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要过量的蛋白与不同 pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的探针在高浓度电解质(如NaCI) 作用下不会凝聚不同蛋白的适宜 pH范围的宽窄大不相同一般选择最小适 宜pH值为最佳pH值但有些探针的实际情况并不完全如此， 最稳定发探针并 不完全代表活性最好。
这要靠实验验证在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白 的最小量如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重 的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性因为探针溶液中的游离蛋白容 易抢先与标记位点结合，起到“圭寸闭” (Block ing)作用，而胶体金探针标记不上在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳 pH也有一定变化因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性1、抗血清的前处理一般抗血清中IgG的含量为10-25%，而绝大部分为其它蛋白用抗血清直 接制备探针其标记活性与特异性均不理想因此需去除其中多数杂蛋白但处 理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此， 否则会导致IgG活性的大幅降低如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯 化后效果会更好大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的 IgG蛋白其基本步骤如下：⑴取抗血清0.2 ml;(2) 加生理盐水(0.85% NaCl) 0.3 ml，混匀；(3) 逐滴加入饱和(NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4C静置1 h;(4) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清；(5) 加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀；⑹ 逐滴加0.25 ml饱和(NH4)2SO4，充分振荡混匀，4C静置1 h;(7) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清；(8) 重复5〜8步骤一次；(9) 加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；(10) 生理盐水中透析12〜24 h;(11) 在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12〜24 h;(12) 分装，即将使用时4C保存，备用-20C保存。
为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4C下进行对于冻干抗血清或长 时间保存的血清，将生理盐水透析改为 3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解 聚如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针2、亲和纯化抗体的处理亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗一般为羊抗兔、羊抗 鼠或羊抗人的抗体这些抗体一般有两个问题，一是 IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分因此前处理的目的在于脱盐和解聚其基本步骤如下：(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为 0.5-1 mg/ml浓度⑵ 在3 M KCNS (硫氰酸钾)溶液中透析12 h(3) 在2 mMol pH 9.0的硼酸缓冲液中透析12 h (更换透析液数次)(4) 分装备用其它蛋白可参考此方法进行但注意后一种透析液的 pH值应与交联时pH值一致在实际运用中，一般省略去 3M KCNS透析这一步，特别是当蛋白分 子量较小，且为非糖蛋白时我们建议在制备通用探针(如二抗IgG, Protein A， Protein G，Streptavidin)等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也 可以忽略处理步骤3、IgG Fab片段的制备般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。
主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子 量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结 合IgG分子量为150 kD左右，由4个亚基组成，即两条重链(H )和两条轻 链(L)用水解酶(木瓜蛋白酶)水解后可得到两种片段，即 Fab和Fc其中 Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针Fc能够与Protein A和Protein G特异性结合但这种分离只能在有条件的实验室进行其基本过程如下：⑴ 用PBS (pH 7.0,含10 mM EDTA，20 mM盐酸半胱氨酸)溶解纯化的 igG(2) 加固化木瓜蛋白酶(3) 37C处理 5h⑷ 离心，去除固化木瓜蛋白酶(沉淀)(5) 过 Protein G 柱(6) 纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理注：Fab与胶体金结合的pH值为6.54、蛋白与胶体金结合最佳pH测定(例纤维素酶，pI未知)(1)取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 10 nm胶体金；⑵ 用 25 mM K2CO3将 pH 分别调为 3，4，5，6，7，8，9，10;(3) 取一 96孔培养板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取 100 l加 入孔中，重复三次；⑷ 每孔分别加入3 l浓度为1 mg/ml的纤维素酶，混合，室温下放置10-15 min ；(5) 每孔分别加入20 l浓度为10% NaCl溶液，混合，室温下放置10 min;(6) 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低 pH(X);(7) 重复(1)-(5)步，pH 梯度为 X-0.6; X-0.3 ; X ; X+0.3; X+0.6 ; X+1。
8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置 2小时，记录仍保持红色的最低pH1. 如胶体金粒子直径较小(3〜6nm),加NaCl需放置较长时间(几个甚 至十几个小时)后才能观察到颜色变化必要时可放大反应体积(1 ml胶体金)，并借助离心来判断2•有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大5、最小蛋白浓度的确定(1) 用0.22 m微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；(2) 取一 96孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳 pH的胶体金 100 I，重复3次；⑶ 各孔依次加入不同量的蛋白(一般浓度为 0.05-0.1 mg/ml) 1〜20 I，混 匀，室温下放置15min;⑷ 加入20 I 10 % NaCI，室温下放置10min；(5) 颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度6) 为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤注：在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的 130%6、IgG-gold 的制备(1)取两个1.5 ml试管，分别加入1.2 ml 10 nm胶体金；⑵加入适量25 mM K2CO3把pH调整为9.0；⑶分别加入10 l浓度为1 mg/ml IgG，混匀，室温放置10min ；⑷ 分别加入12 l 2% PEG20000,室温放置5 min；(5) 10000 rpm离心20 min，轻轻吸除上清;(6) 用20 l BL溶液重悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新管中；⑺ 分别加20 l甘油，充分混匀；(8) -20 r保存备用。
注意:1) .不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大；2) .不同直径胶体金所需离心速度完全不同以绝大部分探针形成松散沉淀 为原则离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚； 离心力太小，探针无法沉下 最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力3）.在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较 好4）.lgG的最佳交联pH有多种报导，从7.4-9.00 一般认为，7.4时胶体金结 合的蛋白最多，9.0时制备的探针最稳定三、样品的固定、包埋与标记1固定为了减少对标记底物结构的破坏，细胞化学样品固定的时间相对较短，多 为1-3小时环境温度一般在 25 C以下低温固定剂一般采用2-3%甲醛与1%戊二醛甲醛分子量小、渗透快，对 蛋白质结构影响小，可较好地保存其抗原活性但对细胞整体的细微结构保存 欠佳戊二醛对细胞的细微结构保存较好，但往往导致蛋白失去抗原活性因 此，在标记低物不是蛋白质或多肽时（如纤维素、多酚类化合物、-1,3-葡聚糖、 几丁质等），可用常规方法进行4%戊二醛和1%锇酸的双固定2. 包埋根据标记低物的不同，可以选择常规（常温）包埋剂或低温包埋剂包埋样 品如果标记物为蛋白质，特别是性质不稳定或不清楚时，建议使用低温包埋 剂包埋，以最大程度保存抗原活性。
大量实验表明， K4M是目前使用最为普遍的低温包埋剂当选择常温包埋剂时，建议使用 Spurr包埋剂Spurr包埋剂粘性小，易渗透，易操作；包埋块不吸潮，保存时间长3. 标记根据标记程序的不同，标记分直接与间接标记直接标记指胶体金探针直 接与被标记底物结合；而间接标记指胶体金探针通过一或多个中间标记物后与 底物结合间接标记直接标记直接标记需要制备胶体金探针，其好处是标记特异性好，背景小，能够做 阴性对照间接标记无需制备胶体金探针，可以直接购买通用二抗探针，缺点 是标记特异性较难把握，背景较高，不能够做阴性对照在做病毒粒子标记时，直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而 不会增加任何背景影响标记的因素主要包括以下方面：（1） pHpH变化会对探针蛋白的结构与活性中心产生影响， 继而影响到标记强度与特异性在很多情况下探针作用的最佳pH值往往与该蛋白作用的最佳pH值有 一定差别例如有一种来自真菌的纤维素酶本来在 pH 4.8时活性最强，但结合到胶体金上后，pH在6.0左右时最强，当pH到7.2时仍有较强的标记活性2） 离子环境有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性， 其中很多涉及Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+等阳离子。
有时溶液中CX+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导致标 记失败；因此，在配制标记溶液时要注意各种阴阳离子的配伍，添加顺序及溶 液pH3） 温度标记温度对标记活性及特异性影响最大，也最容易出问题以水解酶类做 成的胶体金探针对温度变化也更为敏感，不同温度、不同时间标记出的切片其 视觉效果完全不一样在此特别指出一点，在用内切的水解酶探针时，切忌温 度过低，时间过长，否则会出现标记的扩散现象建议在可能时尽量使用外切 酶探针在使用IgG或Protein A, Protein G探针时，有人认为在 4°C下长时间标记 特异性最好但我们研究发现事实并非如此，在 25C以上的室温下标记20-60 min其特异性更好一般来说，如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在 25 C左右；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在 30 C左右4) 封闭液组成封闭液对封闭有关非特异性活性基团，特别是醛基至关重要在多数情况 下封闭液与探针重悬浮液、标记溶液是一样的目前最常用的封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEG20000等在用IgG、Protein A、Protein G等 标记时，应优先选用 BSA(组分五)；在植物凝集素类探针标记时，应优先选用 PEG2000Q也有人发现IgG探针标记时脱脂奶粉最佳。
如果是用交联蛋白做成的探针，那么封闭液中最好有载体蛋白的成分4•样品的低温包埋的基本程序⑴ 将新鲜样品切成1 X 1 x 3 mm3的小块，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的 磷酸缓冲液(100 mM, pH 7.2)中4 C下固定2 h;(2) 在4C依次用30%、50%乙醇溶液脱水，每步 30 min;(3) 在-20 C 冰箱中依次用 50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶 液脱水，每步60 min ；(注意乙醇溶液首先在冰箱中预冷！)⑷ 在-20 C冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M渗透，每步120 min； 注意不断轻轻摇动样品使渗透完全5) 在4 C K4M 树酯包埋注意包埋剂应尽量装满，否则气泡中的氧气会 抑制包埋剂的聚合6) 在-20 C冰箱中长紫外线照射聚合72 h室温下聚合48 h注意每天翻 动2次样品使紫外光照射均匀7) 聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而 无法切片8) 超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记与其它标记用包埋剂相比，K4M可在-35 C低温下仍保持较低的黏度；K4M 有极性，亲水，易脱水，易标记；聚合后交联度高，易切片。
K4M的配方根据材料的性质确定植物或坚硬的材料包埋剂的硬度要高； 动物或幼嫩材料包埋剂的硬度要低具体参见包埋剂说明1) K4M有毒，须带PVC或PVDV手套谨慎操作溅入眼睛或皮肤时请立 刻用清水冲洗2) 所有脱水乙醇须提前预冷3) 脱水过程中防止样品结霜吸潮5•样品常温包埋(常规)的基本程序(1) 将新鲜样品切成1 X X mm3的小块，立即放入4%戊二醛的磷酸缓冲液(100 mM, pH 7.2)中 4 C 下固定 6- 12 h;(2) 样品用磷酸缓冲液冲洗3次每次5 min;然后在2%锇酸溶液中固定1 h; 冲洗3次，每次5分钟通风橱中戴手套进行，含锇酸废液倒入食用油中！)(3) 在 4C 或室温下依次用 30%、50%、70%、90%、100%、100%、100% 乙醇溶液脱水，每步15 min；(4) 依次用30%、70%、100%的Spurr包埋剂渗透，每步120 min；然后在 100%的Spurr包埋剂中过夜5) Spurr包埋剂包埋可包埋在0.5 ml的离心管中，每管加0.3 ml包埋剂 即可加入纸标签6) 在70 C温箱中聚合12- 16 h0(7) 聚合后的样品可长时间保存。
超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记6. 胶体金直接标记基本程序(1)在培养皿中铺上石蜡膜(parafilm);四周加吸水纸和水以保湿；⑵ 加一滴dd H2O,镍网切片向下漂浮2 min；(3) 另滴50 l封闭液(BL)，将镍网切片向下漂浮30 min；⑷另滴50 l封闭液(BL)，加入2-3 l胶体金探针，充分混匀；将镍网切 片向下漂浮30 min；(5) 标记后镍网的在dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次, 每次5-10 min；晾干；(6) 常规染色，观察7. 胶体金间接标记基本程序(1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min ；(2) 在封闭液(BL)上漂浮30 min ；(3)把一抗用BL稀释100-500倍，将镍网切片向下漂浮30-60 min；⑷dd H2O漂洗两次各5 min,除去多余一抗；(5)在封闭液(BL)上漂浮30 min ；⑹用胶体金探针标记30 min；(7) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3次，每次5-10 min； 晾干；(8) 常规染色，观察8•利用胶体金间接标记法进行双标记的基本程序(1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min ；(2) 在封闭液(BL)上漂浮30 min ；(3) 把一抗A用BL稀释100-500倍，将镍网切片向下漂浮30-60 min；⑷dd H2O漂洗两次各5 min,除去多余一抗 A；(5) 在封闭液(BL)上漂浮30 min ；(6) 用小颗粒胶体金探针 A标记30 min；⑺dd H2O漂洗两次各5 min,除去多余胶体金探针 A；(8) 重复步骤(2)-(7)，其中抗体和探针改用一抗 B和大颗粒胶体金探针B ；(9) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3次，每次5-10 min； 晾干；(10) 常规染色，观察。
9•利用胶体金直接标记法进行双标记的基本程序如果两种探针的重悬浮液相同(如同为 IgG-gold)，可直接混合，按上述5的方法进行单混合时大颗粒胶体金的量要适当增加如果两种探针的重悬浮液差别较大，可分别进行直接标记步骤如下：(1)镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min ；⑵在封闭液1上漂浮30 min；(3) 用胶体金探针1标记30 min；(4) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 2次，每次5-10 min；(5) 在封闭液2上漂浮30 min；⑹用胶体金探针2标记30 min；(7) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3次，每次5-10 min； 晾干；(8) 常规染色，观察10.直接法标记粗提纯病毒(1) 取新覆膜镍网，在用BL稀释500倍的病毒抗血清上漂浮3 min；(2) 在病毒溶液上吸附10 min；(3) BL 封闭 30 min；⑷ 一抗胶体金探针标记30-120 min；(5) 水洗3次，每次5-10 min；⑹ 2%醋酸双氧铀负染注意:(1) 如果使用间接标记方法，不能采用或只能采用高度稀释的抗体吸附病 毒否则，高强度的标记背景影响正确判断。
2) 该方法允许多探针直接混合一步法同时标记多种病毒特别适应于对 未知病毒的检测胶体金标记技术路线的选择1. 包埋剂根据抗原或标记底物性质决定包埋剂种类蛋白类，推荐使用K4M ;包埋后立即切片标记外泌蛋白可选择spurr可长期保存使用细胞结构组分，如纤维素、-1,3-葡聚糖、几丁质、多酚化合物等，可选择spurr2. 胶体金体积精细定位如病毒、细胞器定位等选用 5 nm胶体金细胞壁组分采用15-20 nm胶体金多标记时，胶体金直径推荐选用 6 nm、10 nm、15 nm；稳定抗原 采用较大颗粒胶体金一般蛋白标记采用 10 nm3•通用探针选择IgG-gold : -20 °可保存1年；但定位时胶体金距离标记位点较远，不适于 精细定位Protein A/G: -20 °可保存3个月；但定位时胶体金距离标记位点较近，适 于精细定位和多标记Protein A和Protein G与不同抗体之间的亲和性抗体来源IgG类型与Protein A的亲和性与Protein G的亲和性人IgG（正常）++++++++IgG1++++++++IgG2++++++++igG3一++++lgG4++++++++小鼠(mouse)IgG1+++++IgG2a++++++++IgG2b++++++IgG3+++++大鼠(rat)IgG1一+IgG2a一++++IgG2b一++++IgG2c+++山羊(goat)IgG一++绵羊(sheep)IgG—/ +++家兔IgG+++++++狗IgG++++++++猪IgG++++++鸡IgG一+马IgG++++++豚鼠(gui nea-pig)IgG++++++仓鼠(hamster)IgG+++猫igG++++一小牛igG++++++胶体金制备与标记中常见的缓冲液配方1醋酸盐缓冲液(200 mM)pH200 mM NaAc (ml)200 mM HAc (ml)pH200 mM NaAc (ml)200 mM HAc (ml)3.60.759.254.85.94.13.81.208.85.07.03.04.01.88.25.27.92.14.22.657.355.48.61.44.43.76.35.69.10.94.64.95.15.89.40.6200 mM NaAc溶液的配制：NaAc・3H2O定容于1000毫升。
2.磷酸盐缓冲液(PBS, 200 mM)pH200mM Na2HPO4 (ml)200mMNaH2PO4 (ml)pH200mM Na2HPO4 (ml)200mM NaH2PO4 (ml)5.88.0927.061396.012.387.77.272286.218.581.57.481196.426.573.57.687136.637.562.57.891.58.56.849518.094.75.31 M Na2HPO4 溶液的配制：178.05克 Na2HPO4 2H2O 或 358.22 克Na2HPO4 12H2O 定容于 1000毫升1M NaH2PO4溶液的配制：138克 NaH2PO4NaAc・H2O 或 156克 NaH2PO4 2H2O 定容于1000毫升3. Tri • HCI 缓冲液(50mM)pH200mM Tris (ml)100mM HCl (ml)pH200mM Tris (ml)100mM HCl (ml)23 C37 C23 C37 C9.108.95255.08.057.902527.58.928.78257.57.967.822530.08.748.602510.07.877.732532.58.628.482512.57.777.632535.08.508.372515.07.667.522537.58.408.272517.57.547.402540.08.328.182520.07.367.222542.58.238.102522.57.207.0525458.148.002525.050 mM Tris溶液的配制：36.3克Tris定容于1000毫升4.硼酸盐缓冲液（200 mM）pH50mM Na2B4O7 (ml)200mMH3BO3 (ml)pH50mM Na2B4O7 (ml)200mMH3BO3 (ml)7.41.098.23.56.57.61.58.58.44.55.57.8288.7648.0379.082200 mM H3BO3溶液的配制：12.37克H3BO3定容于1000毫升。
50mM Na2B4O7 溶液的配制：19.07克 N82B4O7 • 3H2O 定容于 1000 毫升5.碳酸盐缓冲液（100 mM）pH100 mM Na2CO3 (ml)100 mMNaHCO3 (ml)pH100 mM Na2CO3 (ml)100 mMNaHCO3 (ml)20 C37 C20 C37 C9.168.771910.149.99649.409.122810.2810.08739.519.403710.5310.28829.789.504610.8310.57919.909.7255100 mM Na2CO3溶液的配制：28.62克Na2CO3定容于1000毫升 100mM NaHCO3溶液的配制：8.4克NaHCO3定容于1000毫升本缓冲液临用前配制，不能长时间保存实验系统中有 Ca2++、Mg2++时不能使用C terminalPepsin PapinProtein A/G bind ng s.ieN terminal图1. IgG的基本结构H，重链；L,轻链；HC,重链保守区；HV， 重链变异区；LC，轻链保守区；LV轻链变 异区箭头为木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的酶切位点。
Fab、Fc分别为木瓜蛋白酶水解后的两种片段Protein A和Protein G可识别Fc部分主要参考文献1. Beesley JE ed. Im muno cytochemistry, a Practical Approach. Oxford Un iversity Press. 19932. Benhamou N, Lafontaine PJ. 1995. Ultrastructural and cytochemical characterizati on of elicitor- in duced resp on ses in tomato root tissues in fected by Fusarium oxysporumf. sp. radicis-lycopersici. Pla nta 197: 89-023. Benhamou N, Lafontaine PJ, Nicole M. 1994. Seed treatment with chitosan in duces systemic resista nceto Fusarium crow n and root rot in tomato pla nts. Phytopathology 84: 1432—4444. Brangeon J and Sossutzov L. l993. Electron microscopic in situ hybridization to RNA and DNA in plant cells. in Morel G ed., Hybridization Techniques for Electro n Microscopy. Boca Ratro nt: CRC Press. pp302-3485. Couble P. 1993. Principles of probe preparation forn situ hybridization. In: Morel G ed., Hybridizati on Tech niq ues for Electro n Microscopy. Boca Ratro nt: CRC Press. pp:45-636. Frens G 1973. Con trolled nu cleati on for the regulati on of the particle size in mono disperse gold in the dem on stratio n of cell surface markers. Histochemistry, 72:83-907. Hodges GM, Smolira MA and Livi ngston DC. 1984. Sca nning electro n microscope immuno cytochemistry in practice. in Polak JM and Varn dell IM ed., Immunolabelling for Electron Microscopy. Elsevier Science Publishers B. V pp:l90-2338. Horisberger M and Rosset J. 1977. Colloidal gold, a useful marker for tran smissi on and sca nning electr on microscopy. The J Histochem. and Cytochemi., 25⑷:295-3059. Hyatt AD and Eat on BT ed, Im muno-gold electr on microscopy in virus diag no sis and research. Boca Raton: CRC Press. 199310. McFadden GI. 199l. In situ hybridization techniques: Molecular cytology goes ultrastructural. in; Hall JL ed., Electron Microscopy of Plant Cells. London: Academic Press. pp:2l9-25511. Puvion-Dutilleul F. l993. Procedures of in situ nucleic acid hybridization to detect viral DNA and RNA in cells by electron microscopy. in Morel G ed., Hybridizati on Tech niq ues for Electro n Microscopy. Boca Ratront: CRC Press. pp269-29912. Roth J. l984. The protein A-gold technique for antigen localization in tissue secti ons by light and electr on microscopy .in Polak JM and Varn dell IM ed.,Immunolabelling for Electron Microscopy. Elsevier Science Publishers B. V pp:1l3-12l13. Slot JW and Genze HJ. 1985. A new method of preparing gold probes for multiple-labelli ng cytochemistry. Eur J Cell Biol. 38:87-9114. Slot JW and Geuze HJ. l984. Gold markers for single and double immun olabelli ng of ultrathin cryosect ion. In Polak JM and Varn dell ed., Immunolabelling for Electron Microscopy. Elsevier Science Publishers B. Vpp: 129-14215. Vanden bosch KA. l99l. Immu no gold labelli ng. I n: Hall JL ed., Electro n microscopy of pla nt cells. London: Academic Press. pp:181-2l8浙江大学胶体金免疫标记培训班资料常见胶体金探针制备条件(10ml直径10nm胶体金)探针蛋白来源分子量(kD)交联pH最佳标记pH蛋白用 量(g/ml)重悬浮液特异性标记底物igG哺乳动物150-1607.0-9.0120BL1各种抗原IgG FabIgG水解457.5150BL各种抗原Protein A葡萄球菌42/32(r ecomb)608.260BL多种抗体(Fc片段)Protein G链霉菌45-476.090BL多种抗体(Fc片段)麦胚凝集素(WGA)大麦367.2/9.5125BL几丁质伴刀豆凝集素(ConA)伴刀豆1028.02501mMCa2++1mMMn2+ in BL-甘露糖 > -葡萄糖 >几丁 质蓖麻凝集素I(RCA I)蓖麻1208.060BL-半乳糖 > -半乳糖 >> 几 丁质大豆凝集素(SA)大豆1107.465BLD-氨酰化半乳糖花生凝集素(PA)花生1106.3130BLD-氨酰化半乳糖亲和素(avidin)鸡蛋6711.0120BL生物素(biotin)链亲和 素(streptavidi n)链霉菌607.5200BL生物素(biotin)浙江大学胶体金免疫标记培训班资料-1,3-葡聚糖酶烟草5.5180BL-1,3-葡聚糖纤维素酶绿色木霉9.0/7.5160BL纤维素漆酶(lacasase)白色腐霉4.0100BL (pH 6.0)多酚类化合物通用 BL 配方：50 mM PBS, pH 7.0,,内含 1% BSA, 0.02% PEG20000, 100 mM NaCI, 1% NaN3。