附件5水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法（征求意见稿）1 范围本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定2 原理本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水3.1 试剂3.1.1 正己烷3.1.2 丙酮3.1.3 乙酸乙酯3.1.4乙腈3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O3.1.7 氯化钠3.1.8 复溶液：称取0.12g磷酸二氢钠 (3.1.5)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16g (3.1.6)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B取溶液A 2.8ml、溶液B 7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至100ml，得磷酸盐缓冲液。
3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀3.2 标准物质氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%表1 氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量氯霉素chloramphenicol56-75-7C11H12CL2N2O5323.13注：或等同可溯源物质3.3标准溶液配制3.3.1 氯霉素标准储备液（1 mg/mL）：精密称取氯霉素标准品（3.2）适量，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL 的氯霉素标准储备液4℃避光保存，有效期6个月3.3.2 氯霉素标准中间液A（10μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1 mg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成 10 μg/mL的氯霉素标准中间液A4℃避光保存，有效期3个月。
3.3.3 氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10μg/mL）（3.3.2）0.01 mL分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01 μg/mL的氯霉素标准工作液临用新配3.4材料3.4.1固相萃取小柱：Cleanert Silica，200mg/6mlLOT：01701983.4.2免疫胶体金试剂盒（在2℃～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）3.4.2.1 金标微孔3.4.2.2 试纸条或检测卡4 仪器和设备4.1 移液器：200 μL、1 mL 和5 mL4.2 涡旋混合器4.3 离心机：转速≥4000 r/min4.4 电子天平：感量为 0.01 g4.5 振荡器4.6 样品浓缩仪：如有需要4.7环境条件:温度：15℃～25℃，相对湿度：≤60%5分析步骤5.1试样制备取具有代表性样品约500 g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存5.2试样提取和净化准确称取试样6g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入4mL水和8mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5min，以4000r/min 离心5min。
转移全部乙酸乙酯层于50mL具塞离心管中，加入正己烷25ml，氯化钠1g涡旋混匀，4000r/min 离心1min，上清液待净化5ml丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5ml丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液5.3 测定步骤5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤吸取150µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 5～10 次使混合均匀，室温温育3 min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8 min，对结果进行判定5.3.2 试纸条与金标微孔测定步骤吸取150µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10 次使混合均匀，室温温育3 min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5 min内进行结果判定5.3.3 检测卡测定步骤吸取150µL样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8 min，对结果进行判定。
5.4质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验5.4.1 空白试验称取空白试样，按照 5.2和5.3 步骤与样品同法操作5.4.2 加标质控试验准确称取空白样品 6 g 或适量（精确至0.01g）置于50 mL 具塞离心管中，加入60 μL氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.1 μg/kg，一式2份，按照 5.2和5.3 步骤与样品同法操作6 结果判定要求通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定目视结果判读依据如图1所示6.1 无效控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效6.2 阳性结果检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性6.3 阴性结果检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性6.4质量控制要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性7 结论如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。
8 性能指标8.1 检测限：氯霉素为0.1 μg/kg8.2 灵敏度：灵敏度应≥98%8.3 特异性：特异性应≥90%8.4 假阴性率：假阴性率应≤1%8.5 假阳性率：假阳性率应≤10%注：性能指标计算方法见附录A9其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标本方法参比标准为GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 (包括所有修改单)附录A定性方法性能计算表表A.1 性能指标计算方法样品情况a检验结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异(χ2)χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1灵敏度（p+）p+=N11/N1.特异性（p-）p-=N22/N2.假阴性率(pf-)pf-=N12/N1.=1-灵敏度假阳性率(pf+)pf+=N21/N2.=1-特异性相对准确度（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。
例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列a由基准方法检验得到的结果；b由本方法检验得到的结果灵敏度的计算使用确认后的结果本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。