分子标记筛选实验DNA提取的实验仪器与耗材准备：水浴锅，高速冷冻离心机，小型离心机， 预冷的异丙醇，1.5ml的灭菌eppondorf管，50 ml的灭菌离心管，70%的酒精， 5M 的 KAc 混合液，研钵，液氮，SDS 抽取液，1M Tri-HCl (pH 8.0)，0.5M EDTA (pH 8.0)，TE (pH 8.0)(相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996)1. DNA小量提取法(SDS小量提取法)F2群体DNA采用SDS小量提取法，步骤如下：1. 取新鲜水稻样本叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮，用电钻 磨碎2. 每管磨碎的水稻叶片中加入700ul已预热至650C的SDS抽取液，迅速搅匀 后置于65oC水浴30min3. 加入200ul预冷的5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，于4oC 10000转离心4min，吸取上层液到另一准备好的1.5ml eppondorf管中4. 加入等体积预冷的异丙醇，置于-200C 30min后，4°C 10000转离心4min5. 弃上清，加入70%乙醇清洗，上下颠倒混匀，小型离心机快速离心弃上清， 倒扣晾十(注：晾十不宜太久，反止DNA难溶)。
6. 将晾十的DNA溶于100ul TE溶液中，4°C保存备用2. DNA大量提取法(SDS大量提取法)亲本DNA和突变体DNA池、正常株DNA池采取SDS大量提取法，步骤如下：1. 取每个水稻新鲜样本叶片羹，放入10ml离心管，加入液氮，用电钻磨碎2. 加入5ml已预热至65oC的SDS抽取液，迅速搅匀后置于65oC水浴20min3. 水浴20min后加入1 ml 5MKAc混合液，上下颠倒充分混匀，冰浴20min， 冰浴期间要将离心管上下颠倒数次4. 加入等体积的氯仿，室温下以3000 (10000 rmp)的速度离心3min，吸取 上清于另一准备好的50 ml离心管中5. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃，可以看见DNA絮状沉淀6. 用玻棒挑出DNA絮状物，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾十7. 将晾十的DNA溶于500ul TE溶液中，4°C保存备用3. PCR扩增体系与反应条件3.1 PCR反应体系终浓度Primer pair (4uM)2ul0.4 uM10Xbuffer2ul1 XbufferMg2(25mM)2ul2.5uMdNTPs(10mM)0.3ul133ulTaq 酶(4u/ul)0.25ul1U/20ulDNA(20ng/ul)2ul1.5ng/ulSterile water11.45ul总体积20ul3.2 PCR反应程序94°C,4min94°C,45s55C（因具体引物而定）,45s '卜（32个循环）72, 45s72C,10min— 4C,保存4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验仪器与试剂：小型电泳槽及配套大小玻璃板，夹条、梳子、黑色的长夹 子（full-length clamps）、灌胶底座（precition caster base ）、注射器及导 管等部件。
l6%丙烯酰胺，TEMED, 10%过硫酸铵溶液，loading buffer（上样缓冲 液），10XTBE buffer（相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996））4.1制胶（6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶）1. 将玻璃板洗净水平放置晾十后，再用含有酒精的纸巾将玻璃表面擦拭干净， 晾十2. 小玻板水平放置，将两个夹条整齐地放于玻板两边，大玻板对应放上；然后 夹上胶条，最好玻璃的边缘用琼脂糖胶封边，防止灌胶的时候漏胶，等琼脂糖胶 十后，随后直接装上电泳仪上，将整个装置水平放置（用水平仪没定）3. 准备凝胶，按以下比例进行配置：每块板取6ml 6%丙烯酰胺和24 ml 1XTBE， 加入20ulTEMED和200ul 10%过硫酸铵溶液（最好现配现用），在干净的小烧杯 混匀5. 灌胶：用玻璃棒引流灌入胶液，当胶面前沿到达顶端即可停止灌胶6. 插梳子：将梳子的平端插入胶室约0.5cm即可注意观察是否有漏胶，要 及时补胶）7. 凝胶约1小时：若需过夜，用保鲜膜封住玻板的上端，或直接往电泳槽中 加1XTBE缓冲液准备跑电泳4.2电泳1. 往电泳槽灌入约500ml的1XTBE，使缓冲液淹没小板玻璃，随后小心拔掉 梳子，用注射器轻轻冲冼各加样孔。
期间注意旋紧电泳槽螺丝，防止漏液2. 接通电极，开始预电泳，一般为恒压200V, 10分钟3. 其间准备样品：5ulPCR产物+ 5ul上样缓冲液（loading buffer）o4. 预电泳结束后，关闭电源，开始点样点样之前再次冲冼加样孔，每个加 样孔可加5ul的样品5. 电泳时，一般用200V如发现散热太大，需用电风扇吹风散热6. 停止电泳：一般情况下，当漠酚蓝即将跑出胶的底部时，即可关闭电源开 关，停止电泳7. 卸胶板时，首先将槽中的缓冲液通过放水孔（drain port）小心卸下玻璃 板记住样本的起始点样孔8. 取出胶板后，先卸去橡胶长夹条，再轻轻地撬开大、小玻板，将凝胶进行 后续的固定一银染一显色4.3银染固定液，0.1M硫代梳酸钠，显影液的配制（使用前5小时配制），染色液的 配制（使用前10分钟配制）（相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996）1. 固定：用刀子轻轻地撬开玻璃板，将凝胶放入盛有100ml新配制的冰醋酸溶 液（每100ml 10%的乙醇加500 Ml冰醋酸为一块板用量）的固定盒中，在摇床 上轻摇5分钟固定液可保留）2. 银染：放入20%硝酸银溶液银染液（1ml 20%的硝酸银/100ml固定液）轻摇 5-8分钟。
3. 水洗：将固定盒中液体小心倒掉，用蒸馏水冲洗三次4. 显影：加入显影液（每100ml 3%的NaOH加500〃l甲醛），在水平摇床上 显色10分钟左右5. 停影：当条带显示出来时，迅速将显影液倒掉，清水冲洗，银染结束。