全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞省科学技术计划项目省科学技术计划项目主要内容主要内容前言前言v 近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合组织和细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞但在骨髓中骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干细胞成为国内外学者研究的重点v 依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软骨、成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组织工程奠定实验基础实验方法实验方法v1、骨髓间充质干细胞的原代分离骨髓间充质干细胞的原代分离及传代及传代培养培养v2、骨髓间充质干细胞的形态学观察、骨髓间充质干细胞的形态学观察v3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制v4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定v5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化、骨髓间充质干细胞多向诱导分化骨髓间充质干细胞的原代分离骨髓间充质干细胞的原代分离及传代及传代培养培养v 10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸泡于体积分数为泡于体积分数为75%乙醇消毒乙醇消毒30 min，于超净台无菌，于超净台无菌操作下取其双侧股骨与胫骨，操作下取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干冲洗，剪去骨两端干骺端，用骺端，用10 mL注射器吸取注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗培养液反复冲洗骨髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以骨髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心离心5 min。
弃上清，以弃上清，以 1109 L-1的细胞浓的细胞浓度接种于度接种于25 cm2塑料培养瓶，置于塑料培养瓶，置于37、体积分数为、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养饱和湿度培养箱中培养24 h后全量换液，后全量换液，2，5 d分别半量换液，分别半量换液，7 d全量换液全量换液待培养瓶中细胞待培养瓶中细胞分裂增殖分裂增殖80%-90%汇合单层时用汇合单层时用1.5 mL Trypsin-EDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血的含血清培养基终止消化，离心细胞悬液，清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心离心5 min弃上清，加入含体积分数为弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的胎牛血清的LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以培养基，将重悬的细胞悬液以1 2比例进行比例进行传代骨髓间充质干细胞的形态学观察骨髓间充质干细胞的形态学观察v 取原代和第取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显微镜代细胞，每日用倒置相差显微镜观察其生长形态及特征并照相记录取生长良好观察其生长形态及特征并照相记录取生长良好的细胞于含的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中冻存，二甲基亚砜的血清中冻存，2周周后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞，后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞，继续于继续于37，体积分数为，体积分数为5%CO2培养箱中培培养箱中培养。
养骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制v 取第取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以代细胞，胰酶消化后计数，以5104个个/孔接种于孔接种于96孔板，每孔加入孔板，每孔加入10 L CCK-8溶液，溶液，37，饱和湿度，体积分数为，饱和湿度，体积分数为5%CO2培养箱孵育培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测仪后，用酶联免疫检测仪于于450 nm波长下检测吸光度值然后在检测第波长下检测吸光度值然后在检测第1，2，3，4，5，6，7天同一时间作相同检测天同一时间作相同检测根据吸光度值绘制细胞增殖曲线根据吸光度值绘制细胞增殖曲线骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定v取融合至取融合至90%左右生长状态良好第左右生长状态良好第3代骨髓代骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞计数，调整待测样本细胞数为计数，调整待测样本细胞数为1109 L-1，分，分装至各装至各PE管中，依次加入单克隆抗体管中，依次加入单克隆抗体CD44、CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每，每管设立同型阴性对照组管设立同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体对照组中不加任何抗体)。
常温避光孵育常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重冲洗细胞，细胞重悬，经流式细胞仪检测分析悬，经流式细胞仪检测分析骨髓间充质干细胞多向诱导分化骨髓间充质干细胞多向诱导分化v 取生长良好的第取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以代骨髓间充质干细胞，以5107 L-1接种于接种于24孔板，待细胞贴壁生长融孔板，待细胞贴壁生长融合至合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入成时，向各诱导孔中分别加入成骨细胞诱导剂骨细胞诱导剂(含地塞米松、含地塞米松、-甘油磷酸钠、维甘油磷酸钠、维生素生素C-2磷酸钠磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂，成软骨细胞诱导剂(含地塞米含地塞米松、转化生长因子松、转化生长因子、维生素、维生素C)，成脂细胞诱导，成脂细胞诱导剂剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)各诱导孔各诱导孔定期换液，以未经处理的骨髓间充质干细胞培养定期换液，以未经处理的骨髓间充质干细胞培养孔作为对照孔作为对照结果结果 刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一接种24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展为梭形、多角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。
7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆形和梭形细胞为多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)第3代骨髓间充质干细胞生长较原代细胞快，以梭形细胞为主(图1C)细胞传代至第8代，细胞增殖活力未见明显变化，主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)v流式细胞仪检测第流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表代骨髓间充质干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一标记物的表达，结果显示：细胞均一表达表达CD44、CD29、CD90，阳性率分别为，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而，而CD45、CD34、CD11b/c则呈阴性表达，分别为则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图图2)v 经成骨诱导剂培养经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节明显，经茜素红染色呈红色结节(图图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基质有大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达质有大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达(图图3C)；经；经vonkossa矿化染色可见矿化染色可见细胞聚集处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达细胞聚集处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达(图图3D)。
骨髓间充质干骨髓间充质干细胞经成软骨细胞诱导剂培养细胞经成软骨细胞诱导剂培养21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色(图图3E)骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞经成脂诱导剂培养经成脂诱导剂培养19 d后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红O染色显示许多细胞的染色显示许多细胞的胞浆内有大量脂质沉淀胞浆内有大量脂质沉淀(图图3F)结论结论v 上述实验结果证实，体外分离培养的上述实验结果证实，体外分离培养的SD大鼠大鼠骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增殖、鉴定的方法传代至第殖、鉴定的方法传代至第3代时，可获得纯度代时，可获得纯度高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞，高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞，为为本研究课题进一步本研究课题进一步实验研究奠定了实践基础以实验研究奠定了实践基础以及提供了数量充足的种子细胞。
及提供了数量充足的种子细胞。