粪便基因组DNA快速提取试剂盒目录号：DN23目录编号包装单位DN230150次❖ 适用范围:适用于快速提取各种粪便DNA❖ 试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成 保存 50次70 ml缓冲液ASL 室温杂质清除剂AB 室温结合液CB 室温抑制物去除液IR 室温漂洗液WB 室温洗脱缓冲液EB 室温蛋白酶K粉（可选） g-20°C—20mg/ml吸附柱AC 室温收集管（2ml） 室温5 ml11 ml25 ml15 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇15 ml20mg50个50个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果杂质清除剂AB升级，可以室温存放，使用更方便储存事项：1. 缓冲液ASL或者结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在70°C水浴几分钟 帮助重新充分溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用2. 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后, 加入1毫升灭菌水溶解，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照 每次使用量（20微升）分装冻存，一20C保存3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子❖ 产品介绍：常规的DNA纯化方式并不能有效地去除粪便中存在的大量抑制因子而导致下游 实验的失败，如PCR不能扩增出所需片段。
该试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的 溶液系统，能有效去除动物粪便中各种影响下游实验（如PCR）的抑制因子，并能高 效地回收粪便中的基因组DNA动物粪便样品经特殊缓冲液ASL重悬后，70C处理5 分钟裂解细菌；离心去除不溶解的杂质，蛋白酶K消化进一步去除蛋白和杂质；然后 基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速 的漂洗一离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最 后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱❖ 产品特点：1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤3. 快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7〜1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应❖ 注意事项1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,OOOrpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
2. 开始实验前将需要的水浴先预热到70°C备用3. 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避 免沾染皮肤，眼睛和衣服若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲 洗4. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应也可以使用水 洗脱，但应该确保pH大于7.5, pH过低影响洗脱效率用水洗脱DNA应该 保存在一20°C°DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释5. PCR可能被过量的DNA （一般大于l^g抑制，使用最小用量的洗脱DNA （适 当稀释）反而可以得到更好的扩增一般加入的洗脱DNA体积不要超过总PCR 反应体积的10%我们建议在PCR反应体系中加入终浓度0.1 “g/的BSA （牛 血清白蛋白）有助于得到最佳扩增效果❖ 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）提示：第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀， 加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！1. 收集约200-220mg粪便到一个2ml离心管，置冰上。
如果是冰冻的标本，加入缓冲液ASL前不能解冻，否则DNA容易降解2. 加1.4ml缓冲液ASL，连续涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一注意完全涡旋混匀，否则会严重降低产量3. 将重悬物70C温育5分钟该加热步骤可以提高3-5倍DNA产量，并且帮助裂解细菌和寄生虫对于某些 难裂解的细胞（如革兰氏阳性菌）可以提高到95°C4. 涡旋振荡15秒，室温放置1分钟最高速离心1分钟沉淀粪便颗粒5. 转移900皿上清到一个1.5ml离心管，加入100M杂质清除剂AB,立刻涡旋振荡 1分钟或者直到完全混匀均一，室温放置1分钟最高速离心3分钟去除杂质6. 转移所有上清到一个1.5ml离心管，最高速离心3分钟7. 转移210皿上清到一个1.5ml离心管，加入20皿蛋白酶K （20mg/ml）溶液，充分混 匀，加入200皿结合液CB，涡旋振荡15秒，充分混匀70C温育10分钟如果产量偏低，可以转移更多的上清，并且相应的按比例提高蛋白酶K和结合液 的和后面的异丙醇使用量8. 冷却后加入100gl异丙醇，涡旋混匀9. 将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集 管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
10. 加入500gl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液11. 加入600gl漂洗液WB （请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒， 弃掉废液12. 加入600gl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液13. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应14. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100—150gl 洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液可事先在65-70C水浴中预热），室温放置2分钟， 12,000rpm离心1分钟将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体 积，但是最小体积不应少于50“，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产 量15. DNA可以存放在2-8，如果要长时间存放，可以放置在一20°C问题与解决方法：问题评论与建议洗脫液没有 DNA或者产量低*样品储存不当-建议：样品应该储存在4C或者一20C*在缓冲液ASL中涡旋匀浆不充分-建议：样品在ASL中充分的涡 旋直到均一。
和结合液CB混匀不充分-建议：上清和结合液CB立即充分间断 涡旋混匀上离心柱前忘记加异丙醇-建议：记住加异丙醇* DNA洗脫不充分-建议：洗脫前在室温放5分钟*第一次使用前，漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议：在漂洗液 WB中加入指定量无水乙醇A260/A280比值异常高*残留RNA过高-建议：洗脫缓冲液加RNase A,室温10-30分钟DNA下游 反应不正常* BSA没有加到PCR反应体系-建议：PCR反应体系中加入终浓度 0.1 “g/的 BSA下游反应中使用的DNA过量了-建议：假如DNA使用太多，可能 会抑制PCR反应，因此可减少洗脫DNA使用量*非特异性扩增条带-建议：洗脫液中目的DNA量太低，背景DNA 过高，可以考虑使用热启动PCR聚合酶*某些目的细胞裂解困难，不充分导致产量低-建议：可以把裂解液 温育时间提高到95C*没有足够DNA洗脫下来-建议：查看上面可能的原因■问题 评论与建议最初的离心步骤第4步骤后没有 *离心力不够漣议：可以尝试14000rpm离心5分钟见到多少上清。