显微镜观察方式比较:1. 明场(Brightfield-BF/H)用于常规镜检,观察;病理或染色标本 优点:1. 应用广泛,操作简单;2. 视野亮度高,均匀;3. 价格相对较低;4. 物镜适用于荧光观察缺点:1. 对比度低(透明或未染色标本);2. 成像没有立体感2. 相差( Phase Contrast-PH)最常规的活细胞观察方式,用于对无色透明的标本进行观察,尤其适用于培养的 活细胞,组织观察优点:目前观测活细胞标本最经济,实用的方法缺点:1•需要特殊的相差物镜(Ph);2. 需要光强高;3•切片不能太厚;4.操作较麻烦;5•荧光效果不如明场物镜物镜上的相位板不同,可以分为正/负相差两种不同的观察效果,负相差多用于 生殖医学中精子形态的观察正负相差的区别在于一个背景更黑,一个样品更 黑)八、、X原理:利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,把通过物体不同部分 的光程差转变为振幅(光强度)的差别,经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位 片的相差物镜实现观测的显微镜在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜 4个特殊之处:1. 环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器 的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
2. 相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光 或衍射光的相位推迟1/4九分为两种:(1) A+相板:将直射光推迟1/4九,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本 结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)2) B+相板:将衍射光推迟1/42两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成 暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗3. 合轴调节望远镜:用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合3. 微分干涉(Differential Interference Contrast-DIC)使被检物体产生三维立体浮雕感觉用于无色透明标本的形状轮廓、内部结构、 运动情况等观测及显微操作等优点:1. 观察效果更直观2. 无需特殊物镜,与荧光观察配合更好缺点:1. 需要光强高2. 调节较复杂3. 不能应用于塑料容器培养物的观察4•霍夫曼(Hoffman Modulation Contrast -HMC)斜射光照射到标本产生折射、衍射,光线通过物镜光密度调节器产生不同阴影, 从而使透明标本表面产生明暗差异,增加观察对比度是提高活细胞和组织的对 比度的斜照明技术。
优点:1. 提高未染色标本的可见性和对比度2. 图像显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕3. 可检测双折射物质(岩石切片,水晶,骨头)4. 可检测玻璃,塑料培养皿中的细胞,器官和组织5. 聚光镜的工作距离可以设计地更长6. RC 物镜也可用于明场,暗场和荧光观察缺点:1. 观察效果与标本方向密切相关2. 操作较复杂3. 必须有多元件,结构复杂的高数值孔径 RC 物镜4. 荧光效果不如明场物镜应用:所有类型的细胞,组织(无论活体,染色,未染色),晶体表面细节,透明聚合 物,玻璃和其他类似材料,尤其适用于显微操作在医疗上的典型应用-辅助生殖5.塑料 DIC(Plastic DIC)ZEISS 公司新型专利设计的 Plas DIC 可观察塑料培养器皿,对较厚的贴壁细胞和卵母细胞效果更明显,是显微操作和 转基因操作的最佳观察方式ZEISS 专利,兼具 DIC 和 HMC 的优势,且不需要特殊物镜6•荧光(Fluorescent-FL)特性:1. 吸收光,必须有激发光源2•荧光波长〉激发波长3.荧光强度极小于激发光强度优点:1.高特异性-靶向标记2. 对细胞刺激小,可以活体染色3. 能进行多重染色-共定位 用途:定位,定性,定量的研究。
7•暗场(Dark Field-DF)原理:丁达尔(Tyndall)效应,微粒对斜射光反射或衍射,增大了人眼可见性 特点:能观察到极其微小的物体,分辨率可达0.02〜0.04 pm (明场为0.4 pm) 缺点:1. 只能观察到物体的存在,运动和外部状态2. 不方便调节3.标本要求高(灰尘、盖片、载片) 应用:微小粒子、细菌形态观察、细菌计数,透明标本观察等8•偏光有些物质在两个呈一定夹角的偏光滤片之间可能呈鲜明的对比,或根据双折射性 能和定向呈现颜色原理:根据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数, 以此判别物质结构的一种显微镜应用:矿物质、化学物品鉴别;鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体;植物病理检 验;鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。