猪抗蓝耳病、圆环病毒病相关基因的鉴定与功能分析猪病已成为当前制约养猪业健康发展的关键因素之一 , 其中猪蓝耳病和圆环病毒病为危害世界养猪生产的两大重要的疫病 PRRSV和 PCV2都是能导致猪繁殖障碍的主要病原 , 此外 , 造成猪的免疫抑制 , 引起其他病原微生物的继发或并发感染 , 给世界的养猪业造成了巨大的经济损失猪的遗传学组成能够影响宿主对病毒的易感研究表明 , 不同的猪种间对PRRSV和 PCV2相关疾病的易感性存在差异是由于宿主遗传差异导致的本研究首先对与 PRRSV抗性相关的两个候选基因 USP18和 Mx1进行了启动子区功能分析 , 然后在实验条件下 , 研究遗传背景不同的莱芜猪和大长杂交商品猪对 PCV2易感是否存在差异以及探讨抗性或易感差异的分子机制 , 寻找与猪抗PPRSV和 PCV2有关的分子标记 主要的研究结果如下 :1. 本研究对比了中国地方猪种大蒲莲猪和杜 - 大 - 长杂交商品猪 USP18基因启动子区活性 , 以及筛选了单核苷酸多态性对 USP18转录的影响我们发现大蒲莲猪的启动子活性明显高于杜 - 大- 长杂交商品猪 (P<0.05);启动子删除试验中 , 当启动子从 -1790 删除到 -1314 时, 其转录活性下降约60%(P<0.05); 同时 MARC-145细胞感染 PRRSV前后 , 在此区段的单核苷酸多态位点 G–1533A 均能提高 USP18基因 mRNA的表达。
群体遗传学分析结果显示等位基因 A 只存在于对 PRRSV抗性更强的中国猪种中这些结果表明猪 USP18基因启动子区的单核苷酸多态位点 G–1533A 多态性是抗 PRRSV的一个潜在的 DNA分子标记2. 猪 Mx1基因启动子区的 -2713 到-2565和 -688 到-431 两个区域存在顺式作用元件通过对扩增的猪 Mx1基因启动子区进行测序和比对 , 发现在 -547 位点发现了一个 275bp 的短散布重复元件 (SINE) 等位基因 B(有 275bp 的插入 ) 主要存在于中国地方猪种中 , 而在西方瘦肉品种中频率很低分别将含有和不含 275bp 片段插入的启动子通过瞬时转染 MARC-145细胞 ,比较其荧光素酶活性结果显示不论是在感染猪繁殖与呼吸综合征 (PRRSV)前还是感染后 ,275bp 片段的插入均显著提高了荧光素酶的活性 (P<0.05) 这些结果表明 Mx1基因启动子区 -547 位点的 SINE插入多态性是一个潜在的抗 PRRSV的 DNA分子标记3. 随机采样 6 周龄的 15 头莱芜猪和 15 头大长杂交商品猪所有的猪只 PCV1,PCV2,PRRSV和 PPV抗原抗体检测为阴性。
随机分成四组 ,莱芜猪和大长杂交商品猪攻毒组各 10 头, 对照组各 5 头攻毒组肌肉注射 3ml(103.8tcid50/ml) 的 pcv2-sd 毒株 , 对照组接种等量的磷酸盐缓冲液攻毒当天被记为 0d攻毒后每天测量体温 , 观察临床症状 , 分别在 0d、4d、 7d、10d、 14d、21d、28d、35d 称重、采集血液 , 利用 pcr及绝对定量 pcr 对血清中的 pcv2dna 病毒拷贝数及细胞因子的变化 (il-1 β、il-2、il-4、il-6 、il-8 、il-10 、il-12 、gm-csf 、ifn- γ、tgf- β1 和 tnf α) 进行分析 ,elisa试剂盒检测 igg 的变化35d 剖杀时采集肺脏、扁桃体、胸腺、回肠、脾脏、肝脏和淋巴结等组织 ,10%福尔马林溶液固定 , 制作组织切片 ,he 染色观察病理变化结果表明 : 从攻毒的 0d 到 35d, 攻毒组莱芜猪与攻毒组商品猪相比 ,60%(6/10)的商品猪出现了猪断奶后多系统衰竭综合征的典型临床症状 , 例如食欲下降 , 咳嗽 , 拉稀和渐进性消瘦 , 偶尔打喷嚏 ; 攻毒 14d 后, 商品猪最显著的症状是皮肤上出现圆形或形状不规则的红紫斑和丘疹 , 主要是在背部和后退部位。
大约一半的商品猪攻毒后 14d 到 28d 间出现了呼吸急促莱芜猪未出现明显的临床症状 , 只出现轻微的厌食 , 咳嗽和发热等症状与对照组相比 , 商品猪从攻毒后的第 10d 开始直肠温度高于 40℃一直持续到 14d莱芜猪体温变化不显著与对照组比 , 在整个攻毒期间莱芜猪的体重无显著变化 , 而商品猪在攻毒后 21d 到 35d 之间平均体重明显低于对照组大长杂交商品猪的肺脏出现不同程度的肺充血 , 严重病例肺泡出血 , 肺小叶间质明显增宽 , 出血严重 , 支气管处出现大量淋巴细胞浸润 肝脏为轻度到中度的肝萎缩 , 花斑肝 , 被膜下淋巴细胞大量减少 , 而莱芜猪攻毒后未出现此类临床症状莱芜猪与大长猪的 igg 总含量在感染 pcv2 期间没有出现显著差异 , 但是莱芜猪 igg 的总含量高于大长猪的总含量在感染 pcv2 的早期 , 莱芜猪血清中il-6(p<0.01) 、il-4 、il-8 和 tgf- β 1 水平均显著上升 (p<0.05), 大长杂交猪血清中的炎性细胞因子 tnf- α的蛋白水平显著上升 (p<0.05), 趋化因子il-8 的表达量持续下降 , 调节细胞因子 il-10 表达水平后期突然显著升高(p<0.05), 综合分析上述细胞因子的表达动态表明 ,pcv2 感染后大长杂交猪出现急性炎症反应 , 导致猪早期抗病毒能力和趋化功能降低 , 使大长杂交猪的免疫调节机能出现抑制和紊乱。
大长杂交商品猪血清中的 pcv2dna 病毒的拷贝数均高于莱芜猪 , 且在攻毒后第 35d 达到了显著性差异 (p<0.05) 4. 利用 rna-seq 技术分析了莱芜猪和大长杂交商品猪感染 pcv2 后肺脏组织的差异基因表达的情况 , 两个品种共找出了374 个差异表达基因 , 莱芜猪攻毒组与对照组相比 , 有 83 个上调基因和 86 个下调基因 ; 商品猪中 187 个上调基因 ,18 个下调基因在这些差异表达基因中 , 两个猪种中 5 个共同上调基因和 4 个下调基因对差异表达基因进行 GO功能注释发现大长杂交商品猪中有 150、160 和 156 个基因被注释到生物学过程、细胞组分和分子功能的条目中 ; 莱芜猪有 149、134 和 134个基因被分别注释相应的三个条目中374 个差异表达基因被注释到了 KEGG数据库中的 299 条通路中 , 每条通路中的差异表达基因从 1 到 25 个不等其中具有代表性的通路是补体和凝血级联通路、 RIG-I-like 受体信号通路和 B 细胞受体通路定量 PCR结果显示 , 补体凝血级联通路中的肺组织的损伤有关的 4 个基因(TFPI 、SERPINC1、SERPINA1和 SERPINA5)均在攻毒的莱芜猪中显著表达上调 ,而在大长杂交商品猪中的无明显表达变化。
通过对表达谱数据的分析 , 初步筛选出导致 PCV2感染产生不同的肺部病变的差异表达基因综上所述 , 本实验首先对与 PRRSV抗性相关的两个基因 USP18和 Mx1进行了启动子区多态分析 , 结果表明猪 USP18基因启动子区的单核苷酸多态位点 G–1533A多态性和 Mx1基因启动子区 -547 位点的 SINE 插入多态性均可以作为潜在的抗 PRRSV的 DNA分子标记然后对地方猪种和杂交商品猪感染 PCV2抗性或易感性是否存在差异以及存在此差异的分子机制进行了探讨结果显示 , 莱芜猪和大长杂交商品猪对 PCV2感染的生物学反应有所不同 , 二者在感染 PCV2后肺组织中基因的表达也具有较大差异定量 PCR验证分析了凝血通路中的与肺损伤相关的 4 个基因 (TFPI 、SERPINC1、SERPINA1和 SERPINA5),证明 PCV2感染后这 4 个基因在攻毒后的莱芜猪和大长杂交商品猪的肺组织中的mRNA表达水平存在差异本研究寻找到了与大长杂交商品猪感染 PCV2后出现严重肺组织病变的相关易感基因 , 为进一步探讨猪 PCV2的发病机制和得到与抗 PCV2有关的 DNA分子标记奠定基础。