首乌愈瘫片质量标准研究

首乌愈瘫片质量标准研究 　　摘要 目标建立首乌愈瘫片的质量标准方法 采取薄层色谱法对首乌愈瘫片中的决明子、槲寄生、海马、淫羊藿进行判别;采取高效液相色谱法测定制剂中2,3,5,4′四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的含量结果 选定的薄层色谱条件可判别制剂中决明子、槲寄生、海马、淫羊藿;2,3,5,4′四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷在0.052～0.260 μg范围内，和峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9，平均回收率为97.19%，RSD=1.63%结论 本法简单可行，能快速正确地对首乌愈瘫片进行判别和含量测定，可很好地用于首乌愈瘫片的质量控制　　关键词 首乌愈瘫片;二苯乙烯苷;大黄酚;齐墩果酸;淫羊藿苷;HPLC;TLC;质量控制　　Abstract:ObjectiveTo establish the standard for quality control of Shouwu Yutan tablets.Methods Semen Cassiae,Herba Visci,Hippocampus and Herba Epimedii were identified by TLC.The content of 2,3,5,4′tetrahydroxystilbence2OβDglucoside in Radix Polygoni Multiflori was determined by HPLC.Results Semen Cassiae,Herba Visci,Hippocampus and Herba Epimedii could be identified by TLC.It showed a good linear relationship in determining 2,3,5,4′ tetrahydroxystilbence 2O βDglucoside at the range of 0.0520.260 μg,r=0.999 9.The average recovery was 97.19%(RSD=1.63%).Conclusion This method is easy,feasible,accurate and can be used to control the quality of Shouwuyutan Tablets.　　Key words:Shouwu Yutan tablets; 2,3,5,4′tetrahydroxystilbence2OβDglucoside; chrysophanol; oleanolic acid ;icariin;HPLC; TLC; quality control　　首乌愈瘫片为中药6类新药，现在正处于临床前研究阶段，其由制何首乌、决明子、槲寄生、海马、淫羊藿5味中药组成，含有滋补肝肾功效，关键用于肝肾阴虚型中风病的恢复期诊疗。

方中重用制何首乌为君药，槲寄生、决明子共为臣药，海马、淫羊藿稍佐之，以图治中风病之根本本试验参考国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理措施》中的中药、天然药品注册分类及申报资料的要求,结合首乌愈瘫片中关键成份的理化性质,采取薄层色谱法对方中决明子、槲寄生、海马、淫羊藿进行判别,采取高效液相色谱法对制何首乌所含的2,3,5,4′四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷)进行含量测定结果表明本法操作简便、快速、正确,可用于首乌愈瘫片的质量控制　　1仪器和试药　　1.1仪器　　LC2021A 型高效液相色谱仪(日本岛津企业)，包含SPDM10Avp 型检测器、CLASSVP 型色谱工作站;ShimadzuC18 柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);AE240 型电子天平(瑞士Mettler Toledo 企业);KQ250E 型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限企业，250 W,40 kHz)，2、3 μL定量毛细管(美国Drummond Scientific 企业)　　1.2试药二苯乙烯苷对照品(110844202103)、大黄酚对照品(110796202109)、淫羊藿苷对照品(110737202112)、齐墩果酸对照品(110709202104)均购自药品生物制品检定所。

制何首乌、决明子(炒)、槲寄生、淫羊藿购自安徽亳州京苑康药材企业，海马购自济南建联中药店，经山东中医药大学中药判定教研室周凤琴教授判定，均符合《药典》要求首乌愈瘫片样品3批(20210115、20210116、20210117)及缺决明子、槲寄生、海马、淫羊藿阴性对照样品各1批均为试验室自制甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯　　2方法和结果　　2.1薄层判别　　2.1.1决明子的判别[16]取本品5片，研细，称取1 g，加甲醇20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，用5%(质量分数)Na2CO3溶液洗涤3次，每次30 mL，碱液弃去，乙醚液挥干，残渣加无水乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液取缺决明子阴性对照样品1 g,同法制得缺决明子阴性对照样品溶液另取大黄酚对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的大黄酚对照品溶液根据薄层色谱法[7]试验，精密吸收上述供试品溶液、缺决明子阴性对照样品溶液各3 μL及大黄酚对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷乙酸乙酯甲酸(体积比8∶2∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

供试品色谱中，在和对照品色谱对应位置上，显相同颜色的荧光斑点阴性对照无干扰结果见图1　　2.1.2槲寄生的判别精密称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液取缺槲寄生阴性对照样品1 g，按“211”项下方法操作，制得缺槲寄生阴性对照样品溶液根据薄层色谱法[7]试验，精密吸收“211”项下供试品溶液、缺槲寄生阴性对照样品溶液各3 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷丙酮(体积比4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%(φ)的硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清楚供试品色谱中，在和对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点阴性对照无干扰结果见图2[PSD161;S*2〗1.大黄酚对照品; 2～4.供试品; 5.阴性对照图1决明子TLC判别图谱Figure 1TLC Chromatogram of Semen Cassiae in ShouwuYutan tablets[PSD162;S*2〗1.齐墩果酸对照品; 2～4.供试品; 5.阴性对照图2槲寄生TLC判别图谱Figure 2TLC Chromatogram of Herba Visci in Shouwu Yutan tablets　　2.1.3海马的判别取三斑海马药材0.2 g，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至约2 mL，作为对照药材溶液。

取缺海马阴性对照样品1 g，按“2.1.1”项下方法操作，制得缺海马阴性对照样品溶液按薄层色谱法[7]试验，精密吸收“211”项下供试品溶液、海马对照药材溶液、缺海马阴性对照样品溶液各6 μL点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷丙酮(体积比4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%(φ)硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清楚供试品色谱中，在和对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点阴性对照无干扰结果见图3　　2.1.4淫羊藿的判别取“2.1.1”项下乙醚萃取后的水液，以乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，挥干，残渣加乙醇10 mL使溶解，作为供试品溶液另精密称取淫羊藿苷对照品适量，加70%(φ)乙醇制成每1 mL含0.1 mg的淫羊藿苷对照品溶液取缺淫羊藿阴性对照样品1 g，按“2.1.1”项下方法操作，得缺淫羊藿阴性对照样品溶液按薄层色谱法[7]试验，精密吸收供试品溶液、淫羊藿苷对照品溶液、缺淫羊藿阴性对照样品溶液各0.5 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以36%(φ)醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%(ρ)三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视供试品色谱中，在和对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

结果见图4[PSD163;S*2〗1.阴性对照; 2～4.供试品; 5.海马对照药材图3海马TLC判别图谱Figure 3TLC Chromatogram of Hippocampus in Shouwu Yutan tablets　　[PSD164;S*2〗1.淫羊藿苷对照品; 2～4.供试品; 5.阴性对照图4淫羊藿TLC判别图谱Figure 4TLC Chromatogram of Herba Epimedii in Shouwu Yutan tablets　　2.2.1对照品溶液的制备精密称取二苯乙烯苷对照品适量，加流动相制成每1 mL含二苯乙烯苷0.25 mg的溶液，即得　　2.2.2供试品溶液的制备取本品5片，研细，称取0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声处理20 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足失去的质量，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得　　2.2.3阴性对照溶液的制备按处方百分比称取缺制何首乌的其它药材适量，根据首乌愈瘫片的制备工艺和供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液　　2.2.4色谱条件和系统适用性试验采取十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇水(体积比35∶65)为流动相，流速1.0 mL·min1，检测波长为320 nm。

分别精密吸收对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各0.5 μL注入液相色谱仪，理论板数按二苯乙烯苷计不得少于2 000，阴性对照溶液在和二苯乙烯苷相同保留时间的位置无色谱峰的出现，见图5　[PSD165〗1.二苯乙烯苷图5二苯乙烯苷对照品(A)、首乌愈瘫片(B)和阴性对照(C)的HPLC图谱Figure 5HPLC Chromatograms of reference substance(A),Shouwu Yutan tablets (B) and negative sample(C)　　2.2.5标准曲线的制备精密称取80 ℃干燥至恒重的二苯乙烯苷对照品，加流动相制成二苯乙烯苷质量浓度为0.26 mg·mL1的溶液，分别精密进样0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL以二苯乙烯苷进样量(X)为横坐标，以对应的峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程Y=4.196×106X+2688×104，r=0.999 9结果表明二苯乙烯苷进样量在0.052～0.260 μg范围内线性关系良好　　2.2.6精密度试验精密吸收质量浓度为0262 mg·mL1的二苯乙烯苷对照品溶液0.5 μL，按“2.2.4”项下方法，连续测定5次，统计峰面积并计算其RSD值。

结果峰面积积分值平均值为568 9862，RSD=0.68%(n=5)，表明仪器精密度良好　　2.2.7稳定性试验按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液(批号20210115)，分别于0、4、8、16、24 h进样0.5 μL，测定峰面积并计算其RSD值结果峰面积积分值平均值为491 551，RSD=0.88%(n=5)，表明样品在24 h内基础稳定　　2.2.8反复性试验取同一批号的首乌愈瘫片样品(批号20210115)5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定结果首乌愈瘫片中二苯乙烯苷的平均含量为15.768 mg·片1，RSD=1.71%(n=5)，表明该方法反复性良好　　2.2.9加样回收率试验取已知二苯乙烯苷含量的样品(批号20210115，二苯乙烯苷为15.768 mg·片1)5份，每份约0.1 g，精密称定分别精密加入二苯乙烯苷对照品甲醇溶液(二苯乙烯苷质量浓度为0.410 mg·mL1)各10 mL，再精密加入甲醇20 mL，超声提取20 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液用微孔滤膜(045 μm)滤过，分别精密进样0.5 μL，测得回收率。

结果见表1表1加样回收率试验　　2.2.10样品测定取首乌愈瘫片样品3批，按“22.2”项下方法处理后依法测定，计算样品中二苯乙烯苷的含量，结果见表2表2样品含量测定　　3讨论　　3.1研究表明[16]，制何首乌和决明子所含的关键有效成份均为蒽醌类化合物，决明子中所含蒽醌类成份关键有大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、决明苷等;而制何首乌中关键含大黄素甲醚、大黄素等，不含大黄酚，故选择对决明子中的大黄酚进行判别　　3.2样品采取甲醇提取、乙醚萃取后直接进样，结果样品色谱中成份较多，干扰严重前后尝试用质量分数1%NaOH、1%Na2CO3、5%Na2CO3溶液进行洗涤，结果发觉质量分数1%NaOH溶液可把大黄酚斑点一并洗去，质量分数1%Na2CO3溶液未去除干扰斑点，而质量分数5%Na2CO3溶液可去除干扰，且样品色谱中大黄酚斑点分离度好，故最终确定用质量分数5%Na2CO3溶液进行洗涤　　3.3本试验对首乌愈瘫片进行的TLC判别斑点清楚无干扰、重现性好;采取HPLC法测定首乌愈瘫片中二苯乙烯苷的含量,色谱峰分离效果良好、阴性对照无干扰,方法简便、可靠,可作为首乌愈瘫片的质量控制方法　　参考文件 　[1] 袁海龙,柳正良,张纯,等.超临界流体萃取HPLC法测定何首乌中大黄酸、大黄素及大黄素甲醚的含量[J].中草药,1999,30(4)：258260. 　　[2] 大岛俊幸,平山总良,齐藤文孝,等.高效液相色谱法测定何首乌和夜交藤中蒽醌类成份的含量[J].药品分析杂志,1996,16(4)：219222.　　[3] 郭青,鲁静.高效液相色谱法测定何首乌及其炮制品中蒽醌类成份的含量[J].药品分析杂志,2021,20(5)：326328.　　[4] 曹爱民,沙明,孟淑智,等.高效液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量[J].中药杂志,1997,22(2)：107108.　　[5] 王京霞,许家鸾.决明子中大黄素和大黄酚含量的测定[J].中医药信息杂志，2021,12(6)：4950.　　[6] 戚爱棣,阎雪梅,王虹,等.液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量[J].天津中医学院学报,2021,21(3)：4950.　　[7] 国家药典委员会.中国药典：2021年版一部[M].北京：化学工业出版社,2021：附录 31.　　。