实验四 动物细胞的传代培养1. 实验目的（1）了解动物细胞培养的基本知识2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的 状态3）掌握动物细胞的传代培养法2. 实验背景与原理2.1 动物细胞培养的基本概念（1）组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中， 使之成活、生长和繁殖严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养值得注意 的是和植物组织培养不同，目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的 结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养通常把 第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽， 需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖注意的是传代的这个“代”与细 胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂 3~5 次，不要混淆4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系若其形态均一，生长 增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞Certified Cells）不同种类 的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及 癌细胞较容易成系，而神经等细胞则较难成系。
按照其生存期可分为有限细胞系 （生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细 胞等，大多异倍体）2.2 动物细胞培养的基本条件体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此 必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面1）营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制 营养成分现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成 分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质培养基中还含 有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态随着细胞数目的增长，酸 性代谢物增多，培养基变黄污染的培养物也会使培养基迅速变黄培养基在使用前还要加血清，它的主要作用有三点：一是提供生长因子、激 素、酶等营养；二是中和有毒物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使 用的胰蛋白酶的毒性第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不 可少的所以，血清的品质对细胞的生长有很大影响，通常换用新的批次的血清 要预先进行血清的筛选实验一般进口的胎牛血清更有利于细胞的生长，但价格 较昂贵，可根据培养细胞的要求选用另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰 胺（Gin）。
2 ）胞外环境条件：主要是温度、气体和 pH 条件这些胞外环境条件应该符 合细胞在体内的生长环境哺乳动物适宜的培养温度是37°C，鸟类是39°C，爬 行类是22〜25°C等；大多动物细胞适宜的 pH 条件都是7.2〜7.4，以不超过pH6.8~7.6 为宜在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多， 培养基的 pH 会下降因此实验室通常使用 CO 气体体积占 5%的空气作为细胞2培养的气体条件，以使 CO 溶解在溶液中形成 NaHCO 和 H CO 的缓冲体系，2 3 2 3维持pH的稳定另外，培养基中加入HEPES (羟乙基哌嗪乙烷磺酸)可更有 效的维持体系的 pH3)无菌：组织培养成功的关键因素之一就是要避免污染，要树立无菌操作观 念，从实验用品、培养基和试剂、操作环境的灭菌消毒到超净台下的实验操作， 每一步都应该严谨规范2.3 培养细胞的形态⑴ 倒置显微镜：培养细胞用倒置显微镜观察倒置显微镜(inverted microscope)组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统在载物台之下倒臵显微镜优点 为物镜与目镜之间工作距离较长，可直接将培养皿，培养瓶等置显微镜操作台上 进行观察或显微注射等工作，这样物镜可以很接近样品而不会受样品厚度的限 制。
通常具有相差物镜2) 培养细胞的形态特点：体外培养细胞绝大多数都是贴壁生长的在培养中大部分细胞都经历由最初脱离机体或瓶壁的立体球形到最终的具有突起的延展细 胞所形成平面单层的形态变化过程细胞分裂增殖时同样也经历此变化过程，才 能附壁继续生长培养细胞的形态变化示意图健康的体外培养细胞的标准是细胞折光性好，透明；胞质中颗粒少；细胞形 态完整，饱满；伸展性好当细胞刚刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反 差变大，胞质中颗粒变多，细胞延展性差随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培 养基中杂质多，培养液很快变黄，且混浊当细胞因未及时传代而缺乏营养时， 细胞也会“变瘦”，变圆脱落增多，培养液变黄3) 体外培养细胞的形态类型 : 细胞在体外培养时由于培养条件比较单一稳定， 缺乏体内的生理调节和动态平衡，细胞常失去原有组织细胞的形态特点，趋于单 一性，出现“返祖”现象根据它们是否贴附于支持物生长的特征，可分为贴附 型生长和悬浮型生长两大类而贴壁生长又主要分为成纤维样，上皮样，多形样 等成纤维样细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似，细胞在支持物表面呈梭形 或不规则三角形生长除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞 也呈本类形态生长。
上皮样细胞具有扁平不规则多角形特征，细胞紧密相连单层 膜样生长起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞 培养时，皆呈上皮型形态生长悬浮样细胞主要是血液或淋巴液中的悬浮生长的 细胞类型2.4 细胞传代培养的一般方法以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和黏蛋白以附着于生长表面不 但不同的细胞系附着于表面的黏附程度有差异，不同状态的细胞这种黏附也有差 异比如衰老的二倍体细胞通常比年轻的二倍体细胞黏附得更牢固绝大多数的 贴壁细胞需要用胰蛋白酶优先催化碱性氨基酸与邻近氨基酸羧基间的肽键水解， 从而分解粘蛋白、糖蛋白，使细胞脱壁；有些细胞系贴壁不强，只要用吸管吹打 即可使细胞脱落分散，而不需要使用胰蛋白酶；还有些细胞贴壁能力很强需要使 用其他的蛋白酶，比如弹性蛋白酶、链霉素的酶等为保障胰蛋白酶的最佳活性， 在进行胰蛋白酶处理前应去除血清、Ca2+及Mg2+离子值得注意的是过度的胰蛋 白酶处理可导致细胞的裂解和活力的丧失悬浮生长细胞的传代一般只需简单的稀释操作即可若需完全更换培养液只 需要离心收集细胞后传代即可3. 实验材料与试剂（1）材料： MCF-7 细胞2） 设备与用品：倒置显微镜，CO培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，过滤2器及0.22«m的水相滤膜，细胞培养瓶，移液管，吸管，小试管，酒精灯，试管 架等。
3） 药品与试剂：RPMI-1640培养基；小牛血清；0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS 缓冲液或D-Hanks缓冲液配制，pH7.4））强酸洗液的配制：先用约 200mL 蒸馏水充分加热溶解重铬酸钾 63 克，再缓 缓加入 1L 浓硫酸并不断搅拌，充分混合溶解洗液腐蚀性较强，操作时注意做 好各方面的防护，并且动作要轻柔，注意安全当洗液的颜色由棕红色变为绿色 时表明已经失效，需重新配制4. 实验方法与步骤实验内容：体外培养细胞的观察及细胞的传代培养1） 培养基等的配制及实验用品的清洗与消毒配制RPMI-1640培养基及0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS缓冲液配制pH7.4）溶 液，并过滤除菌后培养验菌清洗，包装并高压灭菌细胞培养的玻璃用品等细 胞培养的玻璃器皿等进行初步清洗后要用强酸洗液浸泡过夜，然后用蒸馏水彻底 冲洗干净；进行湿热灭菌时一般需至少灭菌 40 分钟；培养过污染细胞的培养瓶 则最好加上用煤酚皂溶液浸泡过夜的步骤；移液管和吸管在包装前要在其管口用 细丝或镊子塞上少许棉花，长约1〜1.5cm，松紧要适宜2） 动物培养细胞的形态观察倒臵显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍 数。
同时可对比观察教师事先准备的污染细胞、死亡细胞，并对培养细胞的密度 有一定感性的认识3） 消化：倒掉旧培养基，加几滴胰酶润洗一下，立即倒掉，再加适量胰酶消 化1〜2 分钟左右，可镜下观察待细胞胞质回缩，细胞间空隙变大时立即停止消化4） 悬浮细胞：沿着培养瓶无细胞的一面倒掉胰酶，加适量培养基，用吸管充 分吹打后，镜下观察是否还有贴壁细胞5） 分装：一般以 1：2 或 1：3 进行分装，即一瓶细胞可传为 2〜3 瓶向分装 好的各瓶细胞中再加入适量的含10% （v/v）血清的RMBI-1640培养液6)拧上盖子(勿拧紧)，做好标记，将培养瓶平放于培养箱中，于37°C, 5%CO2 下培养5. 实验注意事项( 1)要保证实验中的无菌操作，就必须特别注意一些操作上的细节，比如：培 养液等不要过早开瓶；加液时取液用的移液管、吸管勿碰用过的培养瓶瓶口；要 勤过火焰，尤其是瓶口；手要握在移液器刻度之上的位臵；超净台中物品的摆放 要合理，尽量避免双手交叉取物；若有动作失误，勿存侥幸心理，应及时更换移 液管等 2)对于贴壁细胞的传代培养胰酶的消化步骤是关键，要注意胰酶消化的时间 也不能过长，否则不但造成细胞数目的损失，也会对细胞造成损伤，使细胞不易 贴壁生长。
3 )可根据细胞的密度，生长速度及实验周期的要求等适当调整细胞的接种密 度但细胞若接种密度过低，也会造成细胞生长极为缓慢甚至停止生长6. 思考题( 1)将传代整个操作过程连贯思考一遍，总结要想保证传代培养的成功，需要注意哪些环节和细节？( 2 )若细胞消化不足或过消化时应该如何操作才能尽可能保证细胞的数目？( 3)若发现细胞有污染时，为了以后的培养实验，应该做哪些工作？预习问题细胞的原代培养都有哪些方法？。