核蛋白的免疫荧光定位一、目的 学习免疫荧光定位技术，定位细胞核蛋白二、概述免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体 （或抗 原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成 的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光 源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或 抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量， 以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的三、材料1. 荧光显微镜2. 22X22mml.5号盖玻片3. 载玻片4. 100%甲醇5. 1% normal goat serum （NGS） in PBS6. 一抗：鼠抗人增殖细胞核抗原抗体（ Proliferative cell nuclearantigen antibody, PCNA）7. 二抗：FITC标记的羊抗鼠IgM四、操作步骤1. 在22X22mm的1.5号盖玻片上培养细胞理想条件下细胞应长到 50%-70%汇合2. 在-20°C用100%甲醇固定细胞3分钟3. 用 PBS + 1% NGS 洗三次，每次 10 分钟4. 在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。
如果用22X 22mm 盖玻片，则在盖玻片上加 30ul 稀释的抗体，并且将盖玻 片倒置在玻璃载玻片上，然后将载玻片放到湿盒里，在室温温 育5. 用 PBS + 1% NGS 洗三次，每次 10 分钟6. 在湿盒里与稀释为 4ug/ml 的荧光标记二抗室温温育 1 小时7. 用 PBS 洗四次，每次 10 分钟8. 用封片剂将盖玻片封在载波片上，用干净的指甲油将盖玻片封 边，防止盖玻片滑动五、注意事项1. 要在盖玻片一边角落做记号，以知道细胞在盖玻片的那一面2. 一抗的浓度需要经过实验摸索确定审实验九 TOTAL RAN 提取一、 目的掌握RNA的提取过程二、 概述有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活， n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇 抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相抽提后，用异 丙醇将RNA沉淀浓缩模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率由于mRNA分子 的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定 且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑 制其活性，这是本实验成败的关键。
三、 材料及试剂1. Invitrogen TriZOLRNA 提取试剂盒2. 异丙醇3. 70％酒精4. DEPC5. 低温离心机四、 操作步骤1. 全血细胞： 溶血：加300ul的肝素或EDTA 二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的 1.5ml EP 管，室温静置 1min,期间， 轻轻颠倒混匀10次13000〜16000 rpm离心20秒弃上清液， 将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮2. 组织细胞： 将冻存或新鲜的组织，加入液氮让组织块完全冷冻，充分碾磨加入1ml的TriZOL，分混匀，室温静置5mi n3. 取106-7细胞加入1ml的TriZOL中，充分混匀，室温静置5mi n4. 再加入200ul的氯仿，充分混匀，室温静置5min4°C,13000rpm 离心15m in5. 取上清液500ul,加入等量的异丙醇充分混匀室温静置5mi n°4°C, 13000rpm 离心 10min6. 弃上清液，加入75%的酒精500ul, 4C, 13000 rpm离心10分钟7. 弃上清液，加入20ul的DEPC水，混匀8. 紫外分光光度计测定0D260/280,比值大于1.8即可。
五、注意事项所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均 可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用 一次性手套）所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200C烘烤2小时 以上凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸 二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净oDEPC是RNA酶的化学修 饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性 DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心试验所用试 剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟， 再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌 吟作用而破坏mRNA活性但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和 DTT的试剂不能用DEPC处理Tris溶液可用DEPC处理的水配制然 后高压灭菌配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并 尽可能用未曾开封的试剂除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷 酸复合物、RNA酶抑制蛋白等此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在 玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理细胞内总RNA 制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法等。
许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA分离的总RNA可利 用mRNA 3'末端含有多聚(A)+的特点，当RNA流经oligo (dT)纤维素 柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素 上,然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下 经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA纯化的mRNA在70% 乙醇中-70°C可保存一年以上。