实验2：海藻酸钙固定化酿酒酵母生产乙醇1实验目的了解酶与细胞固定化方法并掌握酵母细胞包埋法固定化技术2实验原理：微生物酶是指起着催化作生物体系中特定反应的、由微生物活细胞产生的 蛋白质作为催化剂的微生物酶，它可以加速三种反应：水解反应、氧化反应和合成反应微生物酶可以在活细胞内进行催化作 用，也可以透过细胞作用细胞外的物质；前者称内酶，后者称外酶在使用胞 内酶时，需先将其从细胞中提取出来，这些胞内酶在提取和使用过程中会丧失 活性，而且有些酶促反应需多个酶参与，因此仅固定部分酶无法进行相应的反 应因此将整个细胞固定化，不仅可以避免复杂的酶提取和纯化过程，而且解 决了酶的不稳定性问题将整个细胞固定化时，酶的活性高，操作稳定性好， 可进行连续操作，并可同时进行多步酶促反应使用固定化微生物细胞的条件如下：（1） 酶是胞内酶；（2） 酶在提纯与固定化过程中不稳定；（3） 微生物不含干扰酶促反应的成分；（4） 代谢底物及产物为低分子量物质；（5） 需多步酶促的生化反应微生物细胞固定化的原理是将微生物活细胞利用物理或化学的方法，使细 胞与固体的水溶性支持物相结合，使其既不溶于水，又能保持微生物的活性.对于固 定化细胞，以微生物在固定化后的生长状态可分为：固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞3类.微生物细胞的固定化方法有载体结合法，交联法与包埋法，目前没有通用 的方法用于所有种类的微生物细胞固定化，需根据不同的微生物细胞选择适宜 的固定化方法与条件。
固定包埋法是将微生物细胞用物理的方法包埋在各种载 体之中这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方 法，目前应用最多的是海藻酸钠细胞固定化的优点是：固定化细胞能反复使用，发酵完毕，菌体与发酵液易于分离，后处理工艺简单， 成本降低.固定后的微生物细胞可以实现高密度填充,因而可进行高密度连续的微 生物发酵，极大提高了生产效率.该技术是近代为微生物工程的重要革新，展示着广 阔的前景酵母细胞的固定化就是固定化的增殖细胞将酵母细胞用载体固定起来进 行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养 增殖所消耗的糖分，增加了发酵强度，可实现连续化生产，提高生产效率海藻酸钙是天然凝胶，由海藻酸钠胶体溶液与氯化钙反应，即可得到海藻酸钙 凝胶由于它的亲水性强，通透性能好，又可根据钙的不同浓度，形成具有相当机械 强度的海藻酸钙凝胶!所以它是目前研究和使用固定化细胞很有前途的包埋剂之3实验材料：1. 菌种：酿酒酵母2. YEPD培养基：酵母膏10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，水1000ml,分装100毫升与 500毫升三角瓶中，116°C灭菌20分钟3.4%海藻酸钠溶液：海藻酸钠2克，水50毫升，116C灭菌20分钟，4C存放。
4.0.05moll-1氯化钙溶液：无水氯化钙4.75克，去离子水1000毫升，116°C灭菌20分钟5.10毫升注射器及针头6.100毫升三角瓶（无菌）7.离心机8.50毫升带盖离心管9.恒温振荡器4实验步骤：1. 将酿酒酵母接入YEPD液体培养基，22C振荡培养，离心收集菌体并用无 菌水洗涤2次2. 将2.5克湿菌体悬浮于5毫升无菌去离子水中3. 加入5毫升4%海藻酸钠，充分混匀4. 将0.05moll-1氯化钙溶液移入一只三角瓶中，将针头通过三角瓶的封口塞伸入 三角瓶内，并与注射器相连接5. 将海藻酸钠菌体混悬液移入注射器中，适度加力，将海藻酸钠菌体混悬液 滴入0.05moll-1氯化钙溶中6. 滴完后，将三角瓶移入水浴中，放置1小时7. 倾去溶液，加入100毫升无菌去离子水冲洗1次8. 重新加入50毫升0.05moll-1氯化钙溶液，4C平衡过夜9. 乙醇发酵实验5结果分析1.在酵母的海藻酸钙凝胶颗粒制备时将混合物滴入含CaCl2溶液后，粘稠的 混合物迅速形成小圆颗粒漂浮在溶液上本组看到有部分颗粒中间有一道裂 痕，可能是酵母和海藻酸钠的混合物没有混合均匀2.3个小时后，拆掉密封，立即闻到一股似醪醴的香味。
说明杯中的葡萄糖 在被包埋的酵母细胞中发酵并产生酒精3.本小组杯中最后有一半颗粒飘浮在液体表面，而另一半则沉在杯底，应该 是由于酵母和海藻酸钠的混合物混合不均匀，导致颗粒密度不同形成有的漂 浮，有的沉底现象但此解释存在漏洞，因为按照解释应该会出现悬浮在液体 中的颗粒，可在实验中并未发现6思考题：1固定化酵母生产乙醇与游离酵母生产乙醇相比有哪些优点？微生物细胞经过固定化载体的包埋后，载体的物理和化学性能以及固定化 的方法都会对微生物的生理活性造成一定影响，另外被包埋后由于处于新的环 境状态下，微生物本身生理活性会发生变化，从而进一步影响到微生物的增殖 和发酵性能与游离细胞相比可能会有所不同如对高温的耐受性方面因为微生物发酵是错综复杂的过程，包含几十甚 至上百个生物化学反应，而温度变化直接影响各个酶促生化反应对微生物来 说，温度的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物 理性质及生物合成方向等方面一般来说根据酶促反应动力学来看，随着温度 上升反应速度加快，细胞的生长代谢加快，导致细胞生长繁殖加快，但同时随 着温度的上升，酶失活速度加快，菌体衰老提前，发酵周期缩短因此对任何 发酵过程来说适宜的温度条件是极其重要的。
游离酵母在不同温度下发酵时，随温度升高，残糖浓度经历一个先下降而 后上升的过程而糖利用率和乙醇浓度变化规律则与其相反固定化酵母发酵，随温度升高，各项参数变化规律与游离酵母发酵类似， 但其趋势变化明显趋缓，并且发酵时各参数均好于游离发酵这主要由于固定 化材料的阻碍作用使酵母细胞对外界温度变化表现不明显，可以耐受更高或更 低的温度另外由于固定化材料的包裹，使较大分子的有机酸渗漏到外界环境 中的速度较慢，因此固定化发酵pH值高于游离酵母发酵，维持在3.85~4.21之间由此可见，无论游离酵母还是固定化酵母发酵，最佳发酵温度 为35C，但与游离酵母相比，固定化酵母耐受外界温度变化能力更强2实验中海藻酸钠和氯化钙的作用是什么？海藻酸钠溶液和酵母乳混合后滴到适当浓度的CaCl2溶液中，钙离子与海藻 酸钠羧基部位钠离子进行交换，另一侧链海藻酸也可与钙离子相连，从而形成 交连，在此钙离子与两条海藻酸钠键相连形成凝胶将酵母细胞固定于其中由于磷酸盐会破坏凝胶结构，需要在培养基中保持一定浓度的钙离子，以 维持凝胶结构的稳定性包埋过程温和，具有良好的生物相容性，且对细胞无毒，改变海藻酸钠的 浓度，可以改变凝胶的孔径，有助于细胞的固定化，从而进行细胞新陈代谢产 物的生产。