广 州 大 学综合设计性实验报告学 院 生 命 科 学 学 院 课 程 细 胞 生 物 学 实 验 实验项目 细胞培养 实验题目 小鼠肝细胞的原代培养 专 业 生物技术 年级、班别 生技142 姓 名 徐嘉宽 学 号 1414300030 任课教师 陈鲲 细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养摘要 目的 探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法方法 采用脱臼法处死新生小鼠，结合 酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。
用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养脑和肾直接进行组织块培养结果 比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察 结论 采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态关键词 原代培养 小鼠细胞 组织块法 酶消化法1前 言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节二是严格控制无菌条件3实验用品3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个 用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳小培养皿(装盖玻片)1个 3.2试剂 3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液 （用 浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等 3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等 3.2.3 培养用液： 3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10 （RPMI1640）培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终 浓度各为100国际单位的抗菌素。
3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶 或EDTA—胰蛋白酶液 3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL 盐水瓶装3.3 材料新生白小鼠4实验方法4.1技术路线清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→在小组其他成员已打开腹腔的基础上切取小鼠肾（心肌、脑）组织块→洗去血污 →剔除多余成份→剪成小于1mm³大小的植块→接种→贴壁→培养→观察和记录4.2实验步骤a) 玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等）b) 继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗c) 继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、包装分装培养用液用品d) 继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装培养用液、包装原代培养接种用品e) 消毒原代培养接种用品f) 细胞原代培养(1)洗手 操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室 (2)准备工作： ［1］操作者于超净台内用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后，然后用酒精棉球消毒工作面。
［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸 ［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架 ［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中 ［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装 (3)处死小鼠(脱臼法) →消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）将以处死消毒的小鼠转移至超净工作台内的培养皿盖内，背部朝上培养皿倒扣于包装纸上待用 (4)解剖取肾：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈倒T形剪开皮肤，再用解剖剪剪开腰部两侧肌肉，用眼科剪拿出2个肾脏置于无菌培养皿中 (5)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank6)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm³的组织块（大小尽量一致）用Hank液洗涤，弃Hank液 (7)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作台内中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止 (8)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血清终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液加入培养液重复此操作2—3次。
(9)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名称等信息） (10) 用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好 (11) 翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液 (12) 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从瓶口流出） (13)按相同的方法取出心脏和脑组织，清洗后直接植块培养14) 4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；(15) 观察 至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察： ［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染 ［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高 ［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液无菌室的准备工作如小组方案中所示：1) 从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液；2) 用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液；3) 加入与换液前相同的量的培养液；4) 放回原来的培养箱继续培养。
若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录5结果5.1.图片展示图一：小鼠肾细胞图二：小鼠肾细胞5.2.结果分析(1)小鼠肾细胞培养 肾脏细胞在培养1d后，明显看出细胞开始向组织块四周扩散，既有新生的细胞也有游离的组织块碎片翻转组织块能发现更多游离的细胞图一二中发亮的细胞即为有活力的肾细胞(梭形)失去活力的细胞呈黑色或形状不规则图三：小鼠神经细胞图四：小鼠神经细胞（2）小鼠脑细胞培养 小鼠脑组织块培养，在初始几天并没有发现游离的神经细胞，待培养液颜色变黄（证明细胞有生长）且换培养液后，把脑组织块翻转，在显微镜下发现有一比较明显的神经细胞（如图四所示） 图五：小鼠心肌细胞 图六：小鼠心肌细胞（3）小鼠心肌细胞培养 小鼠心肌细胞采用了酶消化法培养，培养1d后，视野中充满长条纤维状物体，其中大部分为失去活力的心肌纤维细胞，呈黑色有活力的心肌纤维形态如图五六所示，半透明，中间有条纹间隔。
因为心肌细胞生长缓慢，视野中所看到的均为游离的组织块分离出来的细胞6 结果分析与讨论本实验结合酶消化法和组织块法成功地培养出小鼠肾细胞，并且相对单一采用酶消化法或者组织块法细胞贴壁生长的速度要大大提高了原因是因为皮片经胰蛋白酶消化后，表皮很容易从真皮上分离下来此时基底细胞联接较松散，把组织块放置于培养瓶中培养时，基底细胞即可轻易地游离到培养液中，然后在培养瓶底部进行贴壁生长 而单纯的组织块培养没有经过酶消化，单个的细胞不易从组织块上脱落，因此细胞游离出来贴壁生长的速度比较慢因此，通过该实验证明，经过酶消化进行的组织块培养的这种方法是一种改良后的细胞培养的方法，此方法培养的细胞不仅细胞贴壁生长速度快，而且细胞生长的状态也很好 而小鼠心肌细胞和神经细胞生长速度及其缓慢，适合组织块培养，可以互相提供细胞生长所需的环境，在实验中观察到的有活力的细胞都是从原组织块分离出来的细胞用酶消化法培养可能会导致细胞无法存活在实验过程中要时刻注意污染，把培养瓶从培养箱中拿出来和放回去都要把手消毒，显微镜下观察时要把瓶身用酒精擦一遍，防止有脏东西沾在瓶身影响观察。