第十四章 细胞衰老 死亡与癌变 1 14 细胞衰老 死亡与癌变 14 1细胞衰老 cellularaging cellsenescence 在生物机体内大多数细胞都要经历未分化到分化 分化到衰老 衰老至死亡的历程 因此 细胞总体的衰老反应了机体的衰老 而机体的衰老是以总体细胞的衰老为基础的 14 1 1衰老的概念 衰老是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现 是不可逆的生命过程 人体是由细胞组织起来的 组成细胞的化学物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤 造成功能退行性下降而老化 细胞的衰老与死亡是新陈代谢的自然现象 细胞衰老是客观存在的 同新陈代谢一样 细胞衰老是细胞生命活动的客观规律 2 14 1 2细胞的寿限 细胞也同生物体一样 有一定的寿命 体内总有细胞不断地衰老与死亡 同时又有细胞的增殖与新生进行补充 Hayflick界限 Hayflicklifespan 1961年 LeonardHayflick首次报道了体外培养的人的成纤维细胞 humanfibroblasts 具有增殖分裂的极限 他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养 发现 胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后开始衰退和死亡 图14 1 相反 来自成年组织的成纤维细胞只能培养15 30代就开始死亡 左边是只分裂了几代的年轻成纤维细胞 呈现薄层 细长的形态 右边是分离了50次的老的成纤维细胞 开始衰退 并很快死亡 图14 1体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态 3 Hayflick等发现 动物体细胞在体外可传代的次数 与物种的寿命有关 例如 Gal pagos龟的最高寿命是175岁 它的细胞在体外培养时能分裂100次 而小鼠的寿命只有几年 所以从小鼠分离的细胞在体外分裂的次数不超过30次 图 图14 2物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系长寿物种的细胞体外培养的代数比短寿物种的细胞代数多 表明细胞的衰老是由生物本身的程序决定的 灰色部分表示生物的寿命 白色部分部份表示体外培养传代的次数 4 细胞的寿限 各类细胞本身的寿命很不一样 一般说来 能够保持持续分裂能力的细胞是不容易衰老的 分化程度高又不分裂的细胞寿命却是有限的 表14 1列出了成年小鼠各类细胞的寿命 表14 1根据细胞寿命情况将细胞分为三类 第一类细胞的寿命接近于动物的整体寿命 如神经元 脂肪细胞 肌细胞等 第二类是缓慢更新的细胞 其寿命比机体的寿命短 如肝细胞 胃壁细胞等 第三类是快速更新的细胞 如皮肤的表皮细胞 红细胞和白细胞等 它们在正常情况下终生保持分裂能力 举例说明三类不同寿命的细胞各有什么特点 表14 1成年小鼠各类细胞的寿命 5 14 1 3细胞衰老的特征 细胞内水分减少 细胞内水分减少的原因可能是由于构成蛋白质亲水胶体系统的胶粒受时间或其他因素的影响 逐渐失去电荷而相互聚集 胶体失水 胶粒的分散度降低 不溶性蛋白质增多 导致细胞硬度增加 代谢速度减慢而趋于老化 色素生成和色素颗粒沉积 即461页致密体 许多细胞内色素的生成 随着衰老而增加 脂褐素也称老年色素 首先在衰老个体的神经元的胞浆中被发现 它在分裂指数低或不分裂的细胞 如肝细胞 肌细胞和神经细胞中的积聚尤为明显 在人和大鼠的脑皮层和海马中脂褐素的积累是衰老的常见形态特征之一 衰老过程中细胞质膜的变化细胞质膜的流动性降低 随年龄的增大 膜结构中的磷脂含量逐渐下降 使质膜中胆固醇与磷脂的比值升高 但磷脂中不饱和脂肪酸含量及卵磷脂与鞘磷脂的比值却随年龄的增高而下降 使得细胞质膜的粘性增加 流动性降低 再加上质膜发生脂质过氧化反应 使细胞的兴奋性降低 离子转运的效率下降以及对内源性和外源性刺激的反应性也随之降低 6 衰老过程中线粒体的变化有人认为线粒体是细胞衰老的生物钟 研究结果表明 细胞中线粒体的数量随着年龄的增大而减少 而其体积则随着年龄的增大而增大 与衰老关系紧密的是线粒体DNA mtDNA 突变 不少学者发现体细胞中mtDNA突变随年龄而增加存在着与衰老直接正相关性 细胞核的变化核膜内折 染色质固缩化 染色体端粒的缩短 细胞骨架体系的变化细胞骨架被认为是细胞代谢功能的调节者 尤其是微丝系统与细胞增殖和细胞分化的调节直接相关 细胞骨架的改变包括微丝系统的结构和成分发生变化和核骨架的变化 蛋白质合成的变化在细胞衰老过程中蛋白质合成速度降低 原因是由于核糖体的效率和准确性降低及蛋白质合成延伸因子的数量和活性降低所致 7 14 1 4细胞衰老的理论 半个世纪以来 科学家们致力于分析衰老发生的原因及导致衰老变化的机制 提出很多种有关衰老起因的观点或学说 如遗传程序说 体细胞突变论 错误成灾说 自由基理论 线粒体损伤论等 近几年 又有衰老基因和衰老相关基因的研究报道 由于衰老是一个十分复杂的生命现象 又受到多种因素包括环境因素和体内因素的影响 任一角度的阐述都难以使衰老机理得到圆满解释 因而目前仍未形成较为一致的论点 虽然衰老的理论很多 但归纳起来主要分为两类 一类是遗传程序论 另一类是损伤积累论 8 衰老的遗传程序论 geneticprogramtheory 衰老的遗传程序论认为衰老是遗传上的程序化过程 衰老是受特定基因控制的 一切生理功能的启动和关闭都是按照一定程序进行的 这一理论有三方面的证据的支持 Hayflick的细胞培养实验 发现人从30岁开始 人体各种器官的功能有1 的减退 衰老基因控制的早老综合症 symptomsofearlyaging 图14 3 左边是一个正常健康的9岁儿童 右边是一个患早老症的8岁儿童什么是衰老的遗传程序论 geneticprogramtheory 图14 3早老症儿童与正常儿童的比较 9 衰老的损伤积累论 衰老的损伤积累理论认为 由于修复和维持总是少于无限存活的需求而出现的损伤积累 损伤的积累可以通过细胞成分的磨损和撕裂的方式或合成错误的方式出现 这些错误包括DNA复制错误 蛋白质合成错误 最有代表性的理论是错误成灾理论 它是指细胞大分子合成错误成灾 意思说 细胞里的核酸和蛋白质在生物合成中如果由于某些原因发生差错 当变质的非功能蛋白达到一定水平时 出现完全丧失功能的 错误灾难 细胞衰老的端粒假说 mitochondrialtelomeretheory Harley于1990年提出细胞衰老端粒假说 人类染色体末端普遍存在端粒结构 但各类细胞端粒长度各有差异 一般体细胞的端粒比生殖细胞短 人类染色体端粒是由250 1500个进化上高度保守的TTAGGG重复顺序组成 是由端粒酶催化合成的 Harley等发现人体内成纤维细胞端粒每年约缩短14 18bp 而外周血淋巴细胞则每年缩短33bp 正常人二倍体成纤维细胞在体外培养时随代数的增加 细胞中的端粒以一定速率缩短 DNA每复制一次 端粒就缩短一段 人体血细胞与皮肤细胞端粒长度也随增龄而相应缩短 因此 端粒记录着细胞的年龄并预示它死亡的时限 何谓衰老的端粒假说 依据是什么 10 细胞衰老的线粒体损伤论 Cortopassi和Amteim用聚合酶链式反应 PCR 法检查发现 成人心脏 肌肉和脑的线粒体有DNA片段低水平的丢失 胎脑和胎心则无此现象 目前 美 加 日等国多个实验室相继报道 衰老期间人体线粒体DNA出现异常 而且阿尔采默 Alzheimer 病脑组织线粒体中DNA损伤甚为多见 此外 老年糖尿病亦与线粒体DNA的损伤有关等 研究发现老龄人各种mtDNA缺失突变存在突变 热点 即缺失突变的缺失片段5 和3 端断裂位点的侧翼具有4 13bp同向重复序列 如5kb常见缺失的侧翼为13pb的5 ACCTCCCTCACCA重复顺序 动物实验也证实线粒体DNA有随年龄增加 其丢失频率升高现象 11 自由基理论 freeradicaltheory 自由基及其性质 自由基是指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团 所谓未成对电子 就是指那些在原子或分子轨道中未与其它电子配对而独占一个轨道的电子 如AB两个原子各提供一个电子通过共价键形成一个分子A B 这两个电子是配对的 如果在化学反应中发生了均裂 A和B各带走一个电子 它们就是未成对电子 A B A BA 和 B就称为自由基 在正常条件下 自由基是在机体代谢过程中产生的 此外 空气污染 辐射 某些化学物质等都可影响自由基的产生 具有自由基的是一类高度活化的分子 当这种分子与其他物质反应时 力图得到电子 而对细胞及组织产生十分有害的生物效应 自由基对生物大分子的损伤 自由基由于活性强 容易与细胞内的生物大分子发生反应 过多的自由基会对许多细胞组分造成损伤 它们能使质膜中的不饱和脂肪酸氧化 从而使膜内酶活性破坏 膜蛋白变性 膜脆性增加 膜结构发生改变 因而膜的运输功能紊乱以至丧失 它们还能将蛋白质中的巯基氧化而造成蛋白质发生交联 变性 使酶失活 另外它们还能使DNA链断裂 交联 碱基羟基化 碱基切除等 从而对DNA造成损伤 有人认为在衰老的原因中 99 是由自由基造成的 12 5 自由基如何对细胞产生伤害 答 细胞内自由基的浓度过高时 常与生物大分子发生反应 破坏了生物大分子的结构 从而伤害了细胞 这些反应包括 1 自由基与核酸分子中的碱基发生加成反应 OH 等加到碱基 胸腺嘧啶C6或C5 腺嘌呤C8 的双链上 破坏碱基可产生基因突变 2 自由基可加成到膜脂及其他脂类不饱和脂肪酸的双链中 引起脂质过氧化 并可产生新的自由基 如脂质过氧化可使线粒体损伤 导致能量代谢障碍 微粒体损伤 使多聚核糖体解聚 抑制蛋白质合成 溶酶体损伤可使溶酶体膜通透性改变 使机体受到更大损伤 3 自由基常攻击肽链上的脯氨酸残基 引入羰基而生成 吡咯烷酮 经水解与其相邻氨基酸断开 造成蛋白质断裂 此外自由基还引起蛋白质交联 蛋白质残基侧链基发生改变 破坏蛋白质高级结构等 4 自由基的氧化损伤涉及到细胞骨架蛋白 如肌动蛋白是构成微丝的主要蛋白质 用肌动蛋白做实验 发现它的4个一SH为氧化过程的靶子 肌动蛋白与氧化型谷胱甘肽 GSSG 之间形成二硫键可导致分子表面电荷的改变 在老化的红细胞中也可检测出类似的修饰物 用醌处理的细胞中也发现不同肌动蛋白分子或肌动蛋白与其他蛋白质之间形成二硫键 图14Q 1 这种氧化性蛋白质交联引起大分子的聚结 图14Q 1细胞骨架肌动蛋白中巯基氧化的机理 13 衰老的自由基学说 衰老的自由基学说是美国科学家Harman1955年在美国的原子能委员会提出的 题目是 衰老 根据自由基和放射化学提出的理论 这一学说是建立在实验研究的基础上的 核心内容有三条 1 衰老是由自由基对细胞成分的有害进攻造成的 2 这里所说的自由基 主要就是氧自由基 因此衰老的自由基理论 其实质就是衰老的氧自由基理论 3 维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除剂水平可以延长寿命和推迟衰老 老年人皮肤上的老年斑 agespots 就是自由基对细胞破坏的见证 图14 4 图14 4老人斑 自由基攻击细胞的见证 14 机体如何防止自由基的伤害 机体内存在着自由基清除系统 其可以最大限度地防御自由基的损伤 自由基清除系统包括酶促反应和非酶促反应两部分 酶促反应所需酶有谷胱甘肽过氧化物酶 GSH PX 超氧化物歧化酶 superoxidedismutase SOD 过氧化物酶 POP 及过氧化氢酶 catalase CAT 非酶促反应的作用物质主要为一些低分子的化合物 是一些抗氧化作用的物质 统称抗氧化剂 antioxidant 主要有谷胱甘肽 GSH 维生素C 胡萝卜素 维生素E 半胱氨酸 硒化物 巯基乙醇等 此外 细胞内部形成的自然隔离 也能使自由基局限在特定部位 如氧化反应产生的自由基主要粒体内 线粒体作为独立的细胞器可很大限度地阻止自由基的扩散 15 14 2细胞死亡 celldeath 细胞死亡的一般定义是细胞生命现象不可逆的停止 细胞死亡有两种形式 一种为坏死性死亡 是由外部的化学 物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解 另一种为程序性死亡 是细胞在一定的生理或病理条件下按照自身的程序结束其生存 多细胞生物随时都在进行着有规律的程序化细胞死亡 如人类的淋巴细胞系统 神经系统等 如何判断细胞的死亡 16 14 2 1多细胞有机体中细胞数量和质量的控制 在多细胞生物体中 细胞分化发育到一定的阶段 细胞的数量要控制在一定的水平 不能让其无限的分裂和增殖 不同的生物控制的细胞数量水平是不同的 如一个受精的老鼠卵细胞和一个受精的人卵细胞在体积上大小相似 但是成年的老鼠比成年的人要小得多 这主要是细胞数量的差异 那么是什么原因控制着这种数量的差异 这主要是细胞的增殖 细胞的存活寿命和细胞的死亡这三者间有着严格的调控机制 信号控制细胞的增殖单细胞的生物如细菌和酵母都是尽可能快地生长和分裂 它们的增殖速率依周围环境中的营养而定 而多细胞的生物体中的细胞是高度组织化的 细胞的增殖必须靠指令行事 需要补充细胞数量时 由特定的组织发出指令 因此 对于动物细胞的增殖仅有营养是不够的 还必须有指令 这种指令通常来自邻近细胞 由指令决定细胞是进行增殖还是停止进入细胞周期 Rb蛋白参与的细胞周期的调控就是信号控制细胞增殖的典型例子 Rb蛋白如何依赖信号控制细胞的增殖 17 9 Rb蛋白如何依赖信号控制细胞的增殖 答 Rb蛋白是成视网膜细胞瘤蛋白 在脊椎动物的细胞核中Rb蛋白很丰富 它通过与特定的基因调节蛋白相结合 以阻止与增殖有关基因的转录 一些细胞外的刺激细胞增殖的信号如生长因子能够导致G1周期蛋白 Cdk复合物的激活 Rb蛋白的磷酸化改变Rb蛋白的构型从而释放它所结合的与细胞增殖有关的调节蛋白 E2F 启动相应基因的表达 从而使细胞进入S期 图14Q 2 该途径中 第一个被鉴定的信号分子是血小板衍生生长因子 platelet derivedgrowthfactor PDGE 它通过与细胞质膜中的受体结合 激活细胞内的信号传导途径 该信号途径引起的细胞增殖主要是通过细胞分裂进行伤口的愈合 用新生成的细胞取代坏死的细胞 其机理是 当形成血块时 血块中血小板被触发释放PDGE 释放出的PDGE与伤口处的活细胞质膜中酪氨酸蛋白激酶受体结合 引起细胞的增殖分裂 对伤口进行愈合 图14Q 2Rb蛋白对细胞增殖的控制 18 体外培养的大多数动物细胞都需要一些特别的生长因子促使细胞的分裂和增殖 这些生长因子主要是选择性的调控某些与分裂增殖有关基因的表达 进行细胞分裂的控制 表14 2列出一些常见的生长因子以及它们的作用 表中除红细胞生成素外 其它生长因子都能激活多种类型细胞的增殖 表14 2某些生长因子和它们的作用 19 Cdk抑制蛋白控制细胞增殖的质量 细胞有严格的自我调节机制 控制着细胞增殖的质量 如DNA因某种原因造成损伤后 细胞被阻止在S期 G2期就不能进行 在这一调控过程中 Cdk抑制蛋白 Cdkinhibitorproteins 起重要作用 这些抑制蛋白可以阻止Cdk的装配或抑制Cdk的活性 例如当DNA在S期受到损伤时可使抑癌基因P53的产物P53蛋白浓度升高 P53蛋白进一步激活编码Cdk抑制蛋白P21基因的转录和表达 合成的P21蛋白抑制S 期周期蛋白 Cdk复合物的活性 一直等待受损伤的DNA修复和正确复制之后才进入G2期 图14 5 当DNA受到损伤时 P53蛋白合成增加 并被激活 激活的P53促进编码Cdk抑制蛋白P21的基因转录 P21蛋白与S期周期蛋白 Cdk复合物结合 并使它们失活 因此 细胞被阻止在G1期 图14 5P53将细胞阻止在G1期的机理 20 14 2 2程序性细胞死亡 programmedcelldeath PCD 的基本特性 又称为细胞凋亡 apoptosis 程序性细胞死亡是指为维持内环境稳定 由基因控制的细胞自主的有序性的死亡 它涉及一系列基因的激活 表达以及调控等的作用 因而是具有生理性和选择性的 Apoptosis的概念来自于希腊语 原意是指树叶或花的自然凋落 而细胞发生程序性死亡时 就像树叶或花的自然凋落一样 凋亡的细胞散在于正常组织细胞中 无炎症反应 不遗留瘢痕 死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除 不影响其他细胞的正常功能 21 细胞坏死与编程细胞死亡 细胞坏死 necrosis 与细胞程序死亡是两种完全不同的过程和生物学现象 在形态学 生化代谢改变 分子机制 细胞的结局和意义等方面都有本质的区别 图14 6 什么是程序性细胞死亡 与细胞坏死有什么不同 图14 6细胞的两种死亡方式及其比较 22 编程性细胞死亡的特征 程序化细胞死亡具有明显的形态学特征 包括细胞变圆 染色质聚集 分块 胞质皱缩 图14 7 图14 7正常的细胞与编程性死亡细胞形态比较a 扫描电镜观察的正常T 细胞 b 扫描电镜观察的编程死亡的T 细胞的形态 表面可见许多芽 c 用抑制剂处理的正处于膜起泡阶段 membraneblebbingstage 的编程死亡细胞的透射电镜照片 23 编程性死亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段 并向核膜下或中央异染色质区聚集形成浓缩的染色质块 随着染色质不断聚集 核纤层断裂消失 核膜在核孔处断裂 形成核碎片 然后整个细胞通过发芽 bybudding 起泡 byzelosls 等方式形成凋亡小体 apoptoticbody 或通过分隔机制 在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区 靠近细胞膜端的分隔膜与细胞核融合并脱落形成凋亡小体 最后 凋亡小体被周围细胞或单核细胞吞噬 图14 8 图14 8程序性死亡细胞的形态结构变化 24 程序化细胞死亡最突出的生化特征是染色质DNA的有控裂解 并且是由于内源性内切核酸酶基因的活化和表达而造成的结果 这种由内源性内切核酸酶切割的染色质DNA断片大小是有规律的 即都为200bp的倍数 因此 抽提其中的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳时 或进行氯化铯溴化乙锭超速离心时 呈现出梯状 1adder 谱型 图4 9 可作为鉴别是否发生程序化细胞死亡的一个重要的生化标志 图14 9编程死亡细胞的DNA梯状谱型 25 表14 3程序性细胞死亡与细胞坏死的比较 程序性细胞死亡与细胞坏死在形态学 生化反应的改变 分子机制 细胞结局等方面都有本质的区别 表14 3 26 14 2 3程序性细胞死亡的机理 程序性细胞死亡是基因调控作用的结果 有很多基因参与调控程序化细胞死亡过程 调控环节包括信号转导 基因表达 蛋白质生物合成和代谢过程等 这些基因也叫程序化细胞死亡相关基因 程序性细胞死亡的过程 程序性细胞死亡分为两个阶段 一是死亡激活期 activationphase 此阶段主要是接受来自内部或外部的死亡信号 deathsignals 并做出反应 即接受指令并决定死亡 第二阶段是死亡执行期 executionphase 即执行一套死亡程序 包括发生染色质凝缩 并逐步分布在核膜周围 接着发生细胞质浓缩 此时桥粒和中间纤维的连接被破坏 膜泡形成凋亡小体 最后被吞噬细胞吞噬和降解等 程序性死亡的细胞之所以能够被吞噬细胞识别和吞噬 是因为这些细胞的表面具有 将我吃掉 的信号 这种信号在正常细胞的表面是不存在的 研究得最清楚的被吞噬信号是存在于程序化死亡细胞质膜脂双层外叶的磷脂酰丝氨酸 phosphatidylserine 分子 它一般存在于正常细胞质膜脂双层的内叶 27 秀丽隐杆线虫中参与程序性细胞死亡控制的基因 关于程序性细胞死亡的分子基础研究最初是在秀丽隐杆线虫 Caenorhabditiselegans CE 中获得突破 在胚胎发育期间 秀丽隐杆线虫有1090个体细胞 但在发育过程中有131个细胞死亡 因此 一个成熟的秀丽隐杆线虫有959个体细胞和约1000 2000个性细胞 线虫的成虫分雌雄同体和雄性两种性别 雌雄同体相当于雌性 图14 10 虫体透明 有6对染色体 约3000个基因 图14 10雌雄同体的秀丽隐杆线虫 28 秀丽隐杆线虫的细胞死亡是一种典型的程序性细胞死亡 15个基因 大致可分为4组 分别在不同程度上与CE的PCD有关 图14 11 简述参与秀丽隐杆线虫的细胞程序性死亡基因的分组及相关作用 图14 11秀丽隐杆线虫程序性细胞死亡途径及相关基因 29 ced 3 celldeathabnormal ced 4 ced 9和egl 1四个基因构成了线虫执行死亡的 死亡机器 deathmachinery 遗传学研究发现ced 3和ced 4是细胞杀手 在ced 3或ced 4突变体中 雌雄同体发育中应该死去的131个细胞都活下来了 ced 9可抵消ced 3和ced 4的作用 防止细胞被杀死 因此是存活因子 在ced 3和ced 4的杀死细胞作用中起负调控 进一步的研究发现真正的细胞杀手是ced 3而不是ced 4 ced 3编码的蛋白与哺乳动物中的白细胞介素转换酶 interleukin 1 IL 1 covertingenzyme ICE 号码相类似 ICE属于日益扩大的半胱氨酸蛋白酶家族 该家族至少有30个成员 统称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 caspase Ced 4的作用是转换器 adapter 对ced 3引起的程序性细胞死亡起促进作用 30 动物细胞中蛋白酶解级联系统对程序性细胞死亡的介导 所有的动物细胞都有一种相类似的控制程序性细胞死亡的机制 即通过一个自杀性蛋白酶家族的介导 这种蛋白酶在诱导程序化死亡信号的作用下通过自我切割而激活 激活的自杀性蛋白酶又可激活家族中的其他成员 引起蛋白质酶解的级联反应 在该反应系统中 上一级的信号激活下一级的一个关键蛋白 并快速将其水解 从而使信号得以放大 图14 12 最后 被激活的蛋白酶切割了细胞与程序性细胞死亡相关的关键蛋白 如核纤层蛋白 从而快速引起有控制的细胞死亡 图14 12蛋白酶解级联反应介导的程序性细胞死亡 a 每一个自杀性的蛋白酶以非活性的形式存在 它可以被同一蛋白酶家族中的另一个成员裂解切割而自我激活 b 每一被激活的蛋白酶分子能够切割许多蛋白酶分子 并将它们激活 以这种方式 开始激活的少量蛋白酶通过激活的级联反应 激活大量的蛋白酶 某些被激活的蛋白酶能够切割细胞内一些关键的蛋白 如核纤层蛋白 导致细胞的有控制的死亡 31 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 caspase cysteine containingaspartate specificproteases 级联反应中的自杀性蛋白水解酶就是caspase 由于caspase家族的成员较多 它们作用时分成一些亚组被激活 每一组caspase对应不同的激活信号 如caspase 3 6 7和 8在FAS TNF介导的程序性细胞死亡途径中起作用 而caspase 9和 3一起参与线粒体中Apaf I 细胞色素c介导的程序性细胞死亡 有两类caspase 一类是起始者 initiators 另一类是执行者 executioners 起始caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活 进而对执行者caspase进行切割并使之激活 后者对caspase靶蛋白的水解 导致程序性细胞死亡 一种caspase激活的级联反应导致执行者caspase的激活 非活性的执行者caspase 酶原 被激活的caspase切割 形成几种蛋白片段 其中两个大片段作为执行者caspase的两个亚基相互结合形成有活性的执行者caspase 然后通过对一系列靶蛋白的切割 均在天冬氨酸残基caspase位点 导致细胞的程序性死亡 图14 13执行者caspase在程序性细胞死亡中的作用 32 研究表明 能够被caspase切割的靶蛋白包括以下几类 1 蛋白激酶 caspase能够切割十多种蛋白激酶 如粘着斑激酶 focaladhesionkinase FAK PKB PKC 以及Raf1 如果粘着斑激酶被破坏了 即破坏了细胞的粘着 使得细胞与相邻细胞失去粘着而导致程序性死亡 2 核纤层蛋白 是位于细胞核内膜下的一层纤维结构 对内膜具有支撑作用 核纤层蛋白被切割 导致核纤层解体 核被膜浓缩 3 细胞结构蛋白 一些维持细胞结构必需的蛋白质 如中间纤维 肌动蛋白和凝溶解胶蛋白 gelsolin 等被caspase切割后导致细胞形态的改变 4 与DNA修复相关的酶类遭caspase切割后失活 由于DNA的修复是维持细胞内环境稳定的主要因素 这一因素遭到破坏 合成的DNA难以保证正确 因而导致程序性细胞死亡 5 caspase激活的DNase CAD 抑制蛋白 caspase能够将caspase激活的DNase CAD 抑制蛋白水解 导致这种酶被激活 该酶是一种内切核酸酶 被激活后从细胞质转移到细胞核 与核DNA结合并将DNA切割成片段 33 细胞外信号对程序性细胞死亡的激发 如果细胞外的信号促进程序性细胞死亡 则属于死亡的正控制 若细胞外信号抑制细胞的程序性死亡 则是死亡的负控制 将这种信号称为存活因子 survivalfactors 目前对存活因子是如何作用的 基本不了解 促进程序性细胞死亡的例子很多 也研究得较为清楚 图14 14显示了细胞外信号 肿瘤坏死因子 tumornecrosisfactor TNF 激发细胞的程序性死亡的过程 说明肿瘤坏死因子在细胞程序性死亡中的正控作用 图14 14受体介导的程序性细胞死亡途径 34 细胞内信号对程序性细胞死亡的激发 除了外部信号激发程序性细胞死亡外 细胞内源信号也会激发细胞的程序性死亡 包括 DNA损伤 细胞质中Ca2 浓度过高 极度氧胁迫 产生大量的自由基 等 在内源信号中有些是促进细胞死亡的正控制信号 如细胞色素c 凋亡蛋白酶激活因子 apoptoticprotease activatingfactor Apaf 内源信号中也有抑制细胞死亡的负控制信号 如哺乳动物中的Bcl 2蛋白 Bcl 2protein 和Bcl x蛋白 图14 15是细胞内源信号激发细胞程序性死亡的过程 图14 15线粒体介导的细胞凋亡途径 35 14 2 4程序性细胞死亡的生物学意义 在健康的成年人体的骨髓和肠组织中每小时大约有十亿个细胞死亡 动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对编程性细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力 图14 16 图14 16动物机体的细胞数量控制的途径 36 在形态建成中编程死亡起重要作用 如手指和脚趾在发育的早期是连在一起的 通过编程死亡使一部分细胞进入自杀途径才将单个指加以分开 图14 17 图14 17编程死亡在小鼠足趾形成中的作用 a 开始时足趾是相连在一起的 b 经编程死亡足趾分开 37 另外 对于生物发育成熟后一些不再需要的结构通过程序性细胞死亡加以消除 例如蝌蚪的尾巴就是靠程序性细胞死亡消除的 图14 18 当蝌蚪变成蛙时 尾巴经编程死亡而消除 主要是血液中甲状腺激素的增加诱导细胞的编程死亡 图14 18在蝌蚪向蛙发育中的变态反应中的编程死亡的作用 38 细胞的程序性死亡不仅参与形态建成 而且能够调节细胞的数量和质量 例如在神经系统的发育过程中 神经细胞必需通过 竞争上岗 获得生存的机会 在胚胎中产生的神经细胞一般是过量的 然后通过竞争数量有限的从靶细胞分泌出来的生存因子 只有那些获得足够生存因子的神经细胞才能生存下去 而其他的神经细胞将会通过程序性死亡而消失 图14 19 图14 19程序性细胞死亡对发育中神经细胞数量的调节生成的神经细胞多于能够支持它们生存的生存因子的数量 这些生存因子是由靶细胞释放出来的 某些得不到生存因子的神经细胞则通过编程死亡而消失 39 14 3癌细胞 所谓癌细胞实际上是一种突变的体细胞 这种突变体脱离了细胞社会关于增殖和存活的控制 因此可以无限制的增殖产生肿瘤 14 3 1癌生物学 Cancer 一词源于拉丁语 crab 是用于描述一种由于体内组织的无限生长 最后夺去生命的疾病 癌细胞与正常的细胞有很大的不同 有许多特有的生物学特征 癌的类群根据癌变涉及的细胞类型的不同 癌分为三个类群 癌 carcinomas 是最常见的一种类型 主要是从组织的外表面和内表面生长的癌 如肺癌 乳腺癌和结肠癌等 瘤 sarcomas 主要是源于中胚层形成的支持组织 骨 软骨 脂肪 结缔组织和肌组织等 中形成的癌 淋巴瘤 lymphomas 和白血病 leukemias 是由淋巴和血液产生的癌 白血病主要是指癌细胞已经大量进入血液中 根据癌变涉及的细胞 将癌分为几个类型 40 体外培养的癌细胞生长特性 无论是活体内的癌细胞还是体外培养的癌细胞 它们最重要的特性是失去了生长的控制 正常细胞在体外培养时 细胞通过分裂增殖并铺满培养器皿的表面形成单层 monolayer 后即停止分裂 图4 20a b 这种现象称作接触抑制 contactinhibition 在相同条件下培养的恶性细胞 malignantcells 对密度依赖性生长抑制失去敏感性 因而不会在形成单层时停止生长 而是相互堆积形成多层生长的聚集体 图14 20c d 正常细胞体外培养时 在培养器皿表面形成单层即停止生长 a b 而由病毒转化的或由致癌化学物质诱导的恶性细胞会成堆生长 c d 图14 20正常细胞与癌细胞生长特性比较 41 癌细胞转移 metastasis 恶性肿瘤细胞能够突破其所在环境的束缚 进入淋巴管或血管在体内转移 在新的部位产生致死性的二级肿瘤 图14 21 肿瘤是一种基因病 它与先天性遗传病有何不同 在肿瘤组织中只有极少数的肿瘤细胞能够进行转移 肿瘤细胞侵袭周围的组织和血管 肿瘤细胞经由循环系统进行转移 在新的部位生长形成肿瘤 图14 21肿瘤转移的过程 42 癌细胞的某些特性 癌细胞的染色体的变化正常细胞在生长和分裂时能够维持二倍体的完整性 而癌细胞常常出现染色体异常 主要是非整倍性 aneuploidy 有染色体的缺失或增加 一般来说 正常细胞中染色体整倍性的破坏 会激活导致细胞程序性死亡的信号 引起细胞的程序性死亡 但是癌细胞染色体整倍性的破坏 不会进入程序性死亡 因这种细胞对程序性死亡的信号已不再敏感了 这也是癌细胞区别于正常细胞的一个重要指标 细胞骨架的变化正常细胞的细胞质中有高度组织化的细胞骨架网络结果 而癌细胞中的细胞骨架不仅少而且杂乱无章 图14 22 图14 22正常和癌细胞微管骨架的比较用微管蛋白抗体制备的细胞微管骨架的免疫荧光照片 a 用温度敏感的肿瘤病毒感染并在高温下培养的成纤维细胞 由于在高温下温度敏感病毒在转化细胞中不起作用 所以细胞骨架是正常的 b 同样转化的细胞在低温下培养 表现出转化的表型 细胞骨架的组织遭到破坏 43 Metastasis 44 对生长因子的依赖性体外培养的正常细胞通常对血清有依赖性 即在培养基中补充一定浓度的血清 而血清的作用是提供生长因子 如表皮生长因子 胰岛素等 而癌细胞由于它的生长周期已不受信号的控制 所以对血清就失去依赖性 图14 23 培养基中有没有血清 对癌细胞的生长影响不大 但没有血清时 正常细胞基本停止生长 图14 23血清对正常细胞和癌细胞生长的影响 45 细胞表面变化肿瘤细胞的表面常常出现一些变化 包括增加了一些新合成的特殊成份 消失了某些原有的成份 某些癌细胞能够合成一些新的表面蛋白 由于这些新出现的蛋白具有抗原性 所以常称为肿瘤相关抗原 tumor associatedantigens 癌细胞表面另一种重要的变化是间隙连接减少 如将荧光染料注入正常的细胞后 染料很快向周围细胞扩散 但是将荧光染料注入癌细胞 则只停留在被注射的细胞内 这一实验说明癌细胞之间的通讯连接有了缺陷 蛋白质合成的变化一些恶性肿瘤常常会合成和分泌一些蛋白酶 分泌的蛋白酶能够降解细胞的某些表面结构 降低了细胞粘着 正因为癌细胞失去了粘着特性 使得癌细胞具有在体内转移的能力 46 14 3 2癌的起因 物理和化学致癌物 引起癌细胞的原因很多 大致分为四种类型 化学因素 辐射 病毒和遗传 化学因素主要是各种化学致癌物 物理因素主要是紫外光等的辐射作用 病毒和遗传则是指病毒癌基因和细胞癌基因 化学致癌物英国伦敦医生JohnHill在1761年首次提出化学致癌观点 1775年 另一位英国外科医生PercivalPott获得环境因子与癌发生的相关证据 他发现一些男性烟囱清洁工人的鼻腔和阴囊皮肤等是癌的高发部位 原因是过渡与煤烟接触有关 在过去几十年内 经动物实验 已经从煤烟中分离出几百种致癌化学物质 后来发现煤炭工业 印染工业中的某些化学物质也具有致癌性 表14 4列出了一些常见的化学致癌物质 47 辐射对癌的诱发 人类在自然环境中受到的辐射主要来自太阳的紫外线 外层空间的宇宙射线 cosmicrays 以及自然发生的放射性元素的放射性 emissions 另外 还受到来自医疗 工业和军事活动中人为产生的高能辐射 这些辐射主要是X 射线和放射活性 关于化学致致癌物和辐射等因素对癌的诱发机理目前很不清楚 通过对一些特别致癌物的分析 发现与DNA突变有关 图14 24是几种致癌物对DNA的诱变作用 虽然勿庸置疑食物和环境中的诱变剂是致癌的因素 但大多数致癌的突变主要来自正常代谢过程中的DNA损伤 图14 24化学和UV致癌物的作用机制图中随机挑选了p53基因中7个密码子 这些密码在人的癌症病人中有50 会发生缺失或突变 图中显示了几种不同致癌物 包括苯并芘 Benzo a pyrene 它是在香烟的烟雾中发现的 黄曲霉毒素B1 阳光中的紫外光等作用于该序列引起突变的机理 每一种致癌物都引起一种不同的碱基置换 图中也显示了由于内源代谢引起的脱氨作用 也会导致C T突变 48 14 3 3肿瘤发生 tumorigenesis 的遗传学 虽然癌是一种非常之常见的疾病 但是从细胞水平上看 癌的发生又是极偶然的事件 从遗传上看 癌都是由一个细胞发展而来 由一个失去了增殖控制的细胞发展而来 人体有百万兆的细胞 每天都有几十亿个细胞进行分裂 理论上几乎任何一个细胞都有可能由遗传成份的改变而癌变 但实际上并非如此 肿瘤发生的进程 progression 为什么大多数细胞都不会发生癌变 其中一个主要原因是 细胞的恶性转化需要发生多个遗传改变 即一个细胞发生多次遗传突变 因此肿瘤发生是一个渐进式的过程 涉及多级反应和突变的积累 关于肿瘤发生的渐进性 有两个研究得较深入的例子 即结肠癌 colon 和星形细胞瘤 astrocytoma 一种脑瘤 它们的癌变过程是先后发生几种突变并积累的过程 图14 25 图14 25结肠癌和脑瘤恶性转变的多步发展过程图中的组织学照片揭示结肠癌和脑瘤由正常细胞 转变成良性肿瘤 转变成恶性肿瘤的发展过程中几个明显可分的阶段 a 结肠癌在癌变程中顺序突变事件 注意结肠癌在癌变过程中组织结构由有序向无序的变化 b 星形细胞瘤癌变过程中顺序突变及形态变化 具有与结肠癌发生过程不同的特征 49 某些恶性肿瘤发生的第一步是形成良性肿瘤 begigntumor 良性肿瘤的增殖也不受正常调控作用的控制 但不会侵染其它组织 不能进行远距离转移 根据对结肠癌发生过程的形态变化及突变分析 提出了关于结肠癌发生的遗传渐进模型 图14 26 在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变 如APC基因 adenomatouspolyposiscolon 是结肠癌发生过程中第一个发生突变的基因 而p53基因则是结肠癌发展过程的后期发生突变的基因 图14 26结肠癌发生过程中可能涉及的基因突变及顺序 50 抑癌基因 癌基因与原癌基因 癌的发生涉及两类基因 抑癌基因 Tumorsuppressorgene 与癌基因 oncogene 在正常的二倍体细胞中 每一种抑癌基因都有两个拷贝 只有当两个拷贝都丢失了或两个拷贝都失活了才会使细胞失去增殖的控制 只要有一个拷贝是正常的 就能够正常调节细胞的周期 图14 27a 癌基因是细胞加速器 它们编码的蛋白使细胞生长不受控制 并促进细胞癌变 图14 27b 大多数癌基因都是由与细胞生长和分裂有关的正常基因 原癌基因 突变而来 图14 27抑癌基因与原癌基因突变对细胞的影响a 抑癌基因突变对细胞的影响 b 原癌基因突变对细胞的影响 51 原癌基因 proto oncogene 原本是细胞的正常基因 它们编码的蛋白质在正常细胞中通常参与细胞的生长与增殖的调节 但突变后成为促癌的癌基因 cancer promotingoncogene 导致细胞癌变 原癌基因突变成癌基因 称为原癌基因的激活 有几种可能的机制使原癌基因激活 图14 28 什么是原癌基因 为什么突变后会导致细胞癌变 图14 28原癌基因激活成癌基因a 原癌基因编码区突变 b 调节区突变 c DNA发生重排 52 病毒癌基因与癌的诱发 就癌基因的来源分为两类 一类是细胞癌基因 cellularoncogene c onc 由细胞原癌基因突变而来 另一类是病毒癌基因 viraloncogene v onc 大约已经鉴定了100多种不同的癌基因 它们中的大多数属于RNA肿瘤病毒基因组中的基因 鸡肉瘤病毒 roussarcomavirus RSV 是一种RNA病毒 可使鸡产生肉瘤 第一个病毒癌基因就是在RSV中发现并鉴定的 即src基因 近几年的研究表明 许多致癌病毒中的癌基因不仅与致癌密切相关 而且与正常细胞中的某些DNA顺序同源 从而推测病毒癌基因起源于细胞的原癌基因 图14 29 图14 29RNA肿瘤病毒癌基因起源的模型 53 除了RNA病毒引起细胞癌变外 某些DNA病毒也能引起细胞癌变 表14 5列出了部分与肿瘤有关的DNA病毒和RNA病毒 表14 5部分DNA和RNA肿瘤病毒 54 2 由于肿瘤病毒的感染可引起正常细胞癌变 如何证明非病毒的癌基因也能诱发细胞癌变 答 由于肿瘤病毒的感染会诱发被感染生物的细胞癌变 从癌细胞中分离的DNA是否也具有诱发细胞癌变的能力 在20世纪80年代早期 RobertWeinberg和GeoffreyCooper通过基因转移实验证明非病毒的癌基因也能诱发细胞癌变 图14E 1 图14E 1DNA转移对癌的诱导从人的癌细胞中分离DNA 然后将分离的癌细胞DNA导入培养的正常鼠的成纤维细胞 某些鼠的成纤维细胞进行了恶性转化 将转化的癌细胞注入正常小鼠体内 正常小鼠长出了瘤 55 原癌基因与癌变 细胞增殖受一系列基因表达产物蛋白质的控制 将参与细胞增殖控制的蛋白质分为7种类型 图14 30 根据蛋白质在细胞增殖中的作用 可分为几种类型 它们的编码基因发生突变后对细胞的增殖有什么影响 图14 30参与细胞生长控制的7种类型的蛋白质 56 这7种类型的蛋白质中 有些是原癌基因的编码产物 它们突变后会导致细胞癌变 表14 6列出了部分人体原癌基因和它们突变后引起的癌症 表14 6原癌基因与人类肿瘤 57 根据Pro在细胞增殖中的作用 可分为几种类型 其编码基因突变后对细胞增殖有何影响 细胞增殖受一系列基因表达蛋白质的控制 将参与细胞增殖控制的蛋白质分为7种类型 生长因子 growthfactor 生长因子受体 growth factorreceptor 信号转导蛋白 signaltransductionprotein 转录因子 transcriptionfactor 抗编程死亡蛋白 anti apototicprotein 细胞周期控制蛋白 cell cyclecontrolprotein DNA修复蛋白 DNA repairprotein 这7种类型的蛋白质中 有些是原癌基因编码产物 它们突变后会导致细胞癌变 其中编码 类蛋白的原癌基因突变是显性突变 因为两个拷贝中只要有一个拷贝突变就会激活癌基因 导致细胞癌变 编码 类蛋白的是抑癌基因 它们的突变是隐性突变 只有当两个拷贝都发生突变时 细胞才会癌变 编码 类蛋白的基因发生突变 导致在代谢过程中造成的DNA损伤不能修复 会极大地提高其他类型突变的机率 58 原癌基因突变成癌基因后 其编码产物促使细胞生长不受控制 并使细胞向恶性方向转变 有些癌基因编码活性过度的受体或活性过强的细胞内信号转导蛋白 它们可在没有外源信号的情况下促使细胞过度增殖而癌变 图14 31 图14 31正常的细胞增殖与由癌基因引起无限增殖的比较 a 在正常的静息细胞中 细胞内能被细胞外信号激活的蛋白和基因都是非活性的 b 当正常的细胞受到细胞外生长因子刺激时 这些信号蛋白和基因被激活 细胞进行增殖 c 在癌细胞中 编码信号蛋白的基因突变了 成为癌基因 它的产物不再需要细胞生长因子的作用就具有活性 59 Pathwaysleadingtocancer 60 抑癌基因与癌变 正常细胞转变成癌细胞 是由于一个或多个抑癌基因丢失的结果 目前推测人的基因组织中大约有20多种抑癌基因 表14 7列出了部分抑癌基因及它们的作用 其中包括编码转录因子的基因 p53和WT1 编码细胞周期调节子基因 RB和p16 编码参与信号转导途径调控蛋白的基因 NF1基因 等 在正常细胞中 抑癌基因的产物作为细胞增殖的负调控器 因此 它们的突变将会使细胞的增殖失去控制 表14 7部分抑癌基因的功能及突变后引起的肿瘤 61 RB基因是世界上第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因 为视网膜母细胞瘤易感基因 编码的蛋白称为Rb蛋白 分布于核内 是一类DNA结合蛋白 Rb蛋白的磷酸化 去磷酸化是其调节细胞生长分化的主要形式 一般认为Rb蛋白在控制细胞周期的信息系统中起关键作用 脱磷酸化的Rb具有抑制细胞增殖的活性 是Rb的活性形式 图14 5 RB基因与癌的关系有两种情况 一种是某些家族的青少年人中高频率发生成视网膜细胞瘤 另一种是高龄人中发病的无家族关系 从成视网膜细胞瘤发生的家族性表明该病是可遗传的 关于成视网膜细胞瘤的遗传基础 1971年得到了解释 只有在RB基因的两个拷贝都突变后才会发展成为成视网膜细胞瘤 图14 32 图14 32RB基因突变与成视网膜细胞瘤a 散布发生成视网膜细胞瘤的病人在出生时 RB基因的两个拷贝都是正常的 只是在后来连续自发发生了RB基因的突变导致成视网膜细胞瘤 由于这种情况很少 并需要较长时间 所以是散布发生并在成年之后 b 在家族性成视网膜细胞瘤病人中 他们出生时就携带了一个突变的Rb基因拷贝 后经自发突变 使两个RB基因都成为突变的形式 这样很快发展为成视网膜细胞瘤 62 p53基因编码一种相对分子质量为53kDa的磷酸化蛋白质 命名为P53 P53蛋白主要集中于核仁区 能与DNA特异结合 其活性亦受磷酸化调控 正常P53的生物功能好似 基因组卫士 guardianofthegenome 在G1期检查DNA损伤点 监视细胞基因组的完整性 如有损伤 P53蛋白阻止DNA复制 以提供足够的时间使损伤DNA修复 如果修复失败 P53蛋白则引发细胞凋亡 图14 33a 如果p53基因突变 无P53蛋白合成 细胞会发生癌变或死亡 图14 33b P53蛋白如何获知DNA损伤信号研并导致修复 图14 33P53蛋白的作用模型a p53基因正常 DNA损伤信号使P53蛋白而升高 促使DNA修复 如不能修复 细胞则进入程序性细胞死亡 b p53基因突变 DNA损伤不能修复 导致肿瘤发生或细胞死亡 63 。