郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 A b stra c tro ta tio n 一f la sk e x P e rim e n ts .5 . T h e e f fe c ts o f se e d m e d iu m c o m P o s itio n s a n d f er m e n t io n m e d iu me o m P o sitio n s o n th e L 一Iso le u c in e P ro d u e tio n in f la sk w e re e o n sid e re d ，u sin g sin g le facto r an a l}产515 m e th o d an d o rth o g o n ality e x P e rim e nts，w e g et th e o P tim a l m e d iu m o f D N 一2 1 . In th e o P tim a l m e d iu m ，th e L 一iso le u c in e y ie ld o f D N 一2 1 w a s 8 .9 3 9 /L .K e )r W 0 r d s : L 一Is o le u e in e ，io n b e a m im P la nt in g ，P r o to P la st，g r o w t h e ire le b io a s sa y ，im P ro v e d aP er e hr o m ato gr ap h y 一sP e etro P h o to m e 饰 ，o rth o g o n a l d e sign111郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 目录目录摘 要 ...............................................................................................................................……I A B S T R A C T .....................................… … ，，… ，二，.… ，，二，二，..… ，.，..........................................… … n 目录 .......……、..................................................................................................................……IV引 一言 ..................................................................................................................................…… 1一 文 献 综 述 .........................................................................................................……，..……21 离 子 注 入 技 术 及 在 微 生 物 育 种 领 域 的应 用 ..........................................................……21.1 离 子 注 入 技 术 概 述 .......……，.............................................................................……21.2 离 子 注 入 技 术 的 作 用 机 理 ...............................................................................……21.3 离 子 注 入 技 术 在 微 生 物 领 域 的应 用 实 例 .…，...........……，................................……42 原 生 质 体 诱 变 技 术 在 微 生 物 育 种 中 的 应 用 ..........................................................……72 .1 原 生 质 体 诱 变 技 术 概 述 ..……，...........................................................................……72 .2 原 生 质 体 诱 变 在 工 业 微 生 物 菌 种 选 育 中 的应 用 ............................................……72 .3 原 生 质 体 诱 变 在 工 业 微 生 物 育 种 中 的 应 用 前 景 .........................................…… 103 .L 一异 亮 氨 酸 的应 用 、 测 定 及 生 产 .................……，................................................…… 103 .I L 一异 亮 氨 酸 概 述 .........……，..............................................................................…… 103 .2 L 一异 亮 氨 酸 的 结 构 及 理 化 性 质 ......................................................................…… n3 .3 L 一异 亮 氨 酸 的应 用 ..........................................................................................…… 113 .4 L 一异 亮 氨 酸 的测 定 方 法 ..................................................................................…… 133 .5 L 一异 亮 氨 酸 的 生 产 方 法 及 生 产 概 况 ..............................................................…… 144 立 题 依 据 及 主 要 研 究 内容 ....................................................................................…… 15二 材 料 与 方 法 ..............................................................……，.......................................……171 实 验 材 料 ................................................................................................................…… 171.1 菌 种 ..................................................................................................................…… 171.2 培 养 基 ...................................................……，...................................................…… 171.3 实 验 仪 器 及 设 备 ...........……‘.................................................................……，..…，… 171.4 部 分 试 剂 .................……，.................................................................................…… 181.5 部 分 溶 液 和 试 剂 的 配 方 .................................................................................…… 18郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 目录2 实 验 方 法 ......................……;.........................................................……，.............……，……192 .I L 一异 亮 氨 酸 生 产 菌 A SI .998 原 生 质 体 形 成 与 再 生 条 件 的研 究 ..................…… 192 .2 初 筛 方 法 一 生 长 圈 法 的 探 索 ..........................................................................……212 .3 发 酵 液 中 L 一异 亮 氨 酸 的 测 定 方 法 的 改 良 ....................................................……2 22 .4 N 十注 入 原 生 质 体 选 育 L 一n e 高 产 菌 株 .…，..................................................……，.232 .5 诱 变 菌 株 发 酵 条 件 的研 究 .............................................................................……25三 实 验 结 果 .......................……，....................................................................................……2 91.L 一异 亮 氨 酸 生 产 菌 A SI .998 原 生 质 体 形 成 和 再 生 条 件 的研 究 ........................……2 91.1 钝 齿 棒 杆 菌 A SI .9 98 生 长 曲线 的 测 定 ……，...................................................……2 91.2 青 霉 素 钠 盐 预 处 理 对 原 生 质 体 形 成 和 再 生 的 影 响 .，....................................……2 91.3 蛋 清 溶 菌 酶 对 原 生 质 体 形 成 和 再 生 的 影 响 ..................................................……311.4 转 速 对 原 生 质 体 形 成 和 再 生 的 影 响 .............................................................……322 初 筛 方 法 一 生 长 圈 法 的探 索 .........................................……，................................……3 32 .1 指 示 菌 的验 证 .................................................................................................……332 .2 钝 齿 棒 杆 菌 A SI .10 01 生 长 曲线 的测 定 ……，................................................……332 .3 钝 齿 棒 杆 菌 A SI .100 1 培 养 方 法 的 确 定 .......................................................……342 .4 待 测 菌 培 养 方 法 的 选 择 ...........................................……，...............................……352 .5 钝 齿 棒 杆 菌 A SI .100 1 浓 度 的 确 定 ……，..................................……，.............……，.352 .6 钝 齿 棒 杆 菌 A SI .100 1 加 入 检 测 平 板 时 温 度 的 确 定 ....................................……3 63 改 良纸 层 析 一分 光 光 度 法 测 定 发 酵 液 中 L 一异 亮 氨 酸 ..........................................……363 .1 展 层 剂 中 有 机 溶 剂 与 水 比例 的 确 定 ....……，..................................................……373 .2 展 层 剂 中 茹 三 酮 含 量 的 确 定 ................……，..................................................……373 .3 改 良后 纸 层 析 一分 光 光 度 法 测 定 L 一n e 吸 收 波 长 的确 定 ..............................……3 73 .4 改 良后 纸 层 析 一分 光 光 度 法 测 定 L 一n e 最 佳 洗 脱 时 间 的 确 定 ......................……383 .5 改 良后 纸 层 析 一分 光 光 度 法 的 L 一11e 标 准 曲线 的 绘 制 ..................................……393 .6 实 验 方 法 改 良后 的 重 复 性 检 验 .....……，.........................................................……3 93 .7 实 验 方 法 改 良后 的 回 收 试 验 ……，...................................................................……394 .丫 注 入 原 生 质 体 选 育 L 一异 亮 氨 酸 高 产 菌 株 .......................................................……404 .1 矿 注 入 诱 变 原 生 质 体 的 结 果 ....……，...............................................................……4 04 .2 生 长 圈 法 初 筛 ...........................................................................……，..…，.........……4 0V郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文4 .3 复 筛一 改 良的纸 层 析 一分 光 度 法 ............……，................……，.............……:......……414 .4 突 变 菌 株 遗 传 稳 定 性 试 验 ........................……，..............................................……415 . 诱 变 菌 株 发 酵 条 件 的 研 究 ...................................................................................……425 .1 种 子 培 养 基 的优 化 ...........……，...................................···········，························……4 25 .2 发 酵 培 养 基 的 优 化 ..........................................................……，........······，·········……465.3 摇 瓶 发 酵 条 件 的研 究 ............................................……，..................................……4 95 .4 发 酵 培 养 基 正 交 试 验 ..................................................····································……51 四 全 文 总 结 ..................................................................................................................……541 结 论 .....................................................................................……，............................……542 展 望 ........................................................................................................................……54参 考 文 献 ..........................................................................................................……，..…，.……55己发 表 文 章 ..............................................……，..............................................……，..........……62致 谢 ..........................................................................................................……，..…，.....……63郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 引 言日 !省J I F 刁离 子 注 入 技 术 在 国 内外 最 初 主 要 用 于 处 理 金 属 、 塑 料 、 半 导 体 等 方 面 ， 在 2 0 世 纪 80 年 代 由 中 国科 学 院等 离 子 体 所 余增 亮 等 等 创 造 性 地 将 其 用 于 农 作 物 品 种 改 良，并 取 得 了 显 著 效 果 。
这 种 新 的 核 物 理 与 现 代 生 物 学 结 合 的 育 种 方 法 具 有生 理 损 伤 小 、突 变 谱 广 、突 变 率 高 等 特 点 ，也 已应 用 到 微 生 物 育 种 中 ，并 取 得 了 显 著 的经 济 效 益 微 生 物 原 生质 体 通 常 是 由对 数 生 长 期 的细 胞 制 备 来 的 ，代 谢 旺 盛 ，复 制 频 繁 ， 生 活 力 强 ，对 诱 变 剂 的敏 感 性 也 强 ，诱 变 后 易 于 形 成 单 菌 落 便 于 筛 选 ; 同 时 ，原 生 质 体 还 具 有 细 胞 壁 再 生 能 力 ，保 持 了细 胞 的 全 能 性 ，可 以按 照 常 规 的 细 胞 诱 变 方 式 对 其 进 行 诱 变 ，从 而 提 高 突 变 株 的变 异 幅 度 原 生 质 体 诱 变 技 术 已经 广 泛 应 用 于 工 业 微 生 物 菌 种 的选 育 中 L 一异 亮 氨 酸 是 人 体 必 需 的 8 种 氨 基 酸 之 一 ，也 是 3 种 支 链 氨 基 酸 之 一 ，在 人 类 代 谢 中 具 有 重 要 的地 位 ，现 已广 泛 应 用 到 食 品 、医 药 、化 妆 品 等 方 面 。
同 时 有 研 究 表 明 ，L 一异 亮 氨 酸 是 一 种 高 效 的p 一防 御 素 表 达 的 诱 导 物 和 新 型 的低 分 子 量 凝 胶 此 外 ，L 一异 亮 氨 酸 还 可 以用 来 使 乳 牛 催 乳 、作 饲 料 添 加 剂 ，生 产 功 能饮 料 等 目前 ，L 一异 亮 氨 酸 市 的场 需 求 量 逐 年 增 长 ，但 国 内 L 一异 亮 氨 酸 的 生 产 还 不 能 满 足 需 求 ，而 且 纯 度 不 高 ， 多 依 赖 于 进 口 鉴 于 L 一异 亮 氨 酸 用 途 广 、潜 在 市 场 需 求 量 大 、产 品 附 加 值 高 ，选 育 L 一异 亮 氨 酸 高 产 菌 株 ，提 高其 产 量 和 质 量 ，对 促进 我 国氨 基 酸 发 酵 工 业 的 发 展 具 有 重 大 的 意 义 离 子 注 入 技 术 和 原 生 质 体 技 术 的优 点 各 有 千 秋 ，将 离 子 注 入 这 一 新 型 诱 变 源 与 传 统 的 原 生 质 体 技 术 结 合 ，选 育 氨 基 酸 高产 菌 ，国 内外 尚 未 见 报 道 本 研 究 以 L 一异 亮 氨 酸 生 产 菌 钝 齿 棒 杆 菌 A sl .998 的 原 生 质 体 为 诱 变 对 象 ，采 用 N+ 注 入 的方 法 ， 经 生 长 圈 法 初 筛 ， 改 良 的 纸 层 析 一分 光 光 度 法 摇 瓶 复 筛 ，选 育 出 产 量 提 高43 .66 % 的 菌 株 D N 一21 。
通 过 遗 传 稳 定 性 实 验 ，表 明 该 菌 株 具 有 良好 的 遗 传 稳 定 性 最 后 ， 用 单 因 素 法 考 察 了 不 同 的 发 酵 条 件 对 产 L 一异 亮 氨 酸 的 影 响 ，运 用 正 交 试 验 设 计 对 种 子 培 养 基 和 发 酵 培 养 基 的摇 瓶 发 酵 条 件 进 行 了优 化 ，确 定 了最 佳 发 酵 条 件 采 用 优 化 后 的 培 养 基 及 发 酵 条 件 进 行 摇 瓶 发 酵 实 验 ，L 一异 亮 氨 酸 最 高 可 达 8 .9 3g/m L ， 比初 始 菌 株 提 高 了 79 .68 % 郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 文 献 综 述一 文 献 综 述1 离 子 注 入技 术 及 在 微 生 物 育 种 领 域 的应 用1.1 离 子 注 入 技 术 概 述离 子 注 入技 术 在 国 内外 最 初 主 要 用 于 处 理 金 属 、 塑 料 、半 导 体 等 以增 加 其 抗 磨 性 、抗 腐 蚀 等 ，继 而 用 于 有 机 物 使 其 分 子 量 分 布 和 溶 解 度 发 生 变 化 。
2 0世 纪 80 年 代 中期 ，中 国科 学 院 等 离 子 体 物 理 研 究 所 余 增 亮 等 创 造 性 地 将 低 能 重 离 子 用 于 农 作 物 品种 改 良 ，并 发 现 了 离 子 注 入 对 生 物 的 诱 变 效 应 [’]从 此 揭 开 了 离 子 束 生 物 工 程 的研 究 序 幕 离 子 注 入 技 术 是 通 过 将 低 能 离 子 注 入 生 物 体 (如 植 物 干 种 子 、外 植 体 、愈 伤 组 织 、微 生 物 、动 物 细 胞 等 )内 ，来 研 究 其 生 物 学 效 应 和 作 用 机 理 ，广 泛 地 应 用 于 遗 传 育 种 、基 因工 程 、生 命 起 源 和 分 化 等 方 面 的 一 种 新 型 综 合 技 术 该 技 术 具 有 设 备 简 单 、生理 损 伤 小 、突 变 谱 广 、突 变 频 率 高 等 优 点 ，并 具 有 一 定 的 重 复 性 和 方 向性 ，已 引起 了 国 内外 专 家 的 普 遍 关 注 ，有 着 广 阔 的 发 展 前 景 1.2 离 子 注 入 技 术 的作 用 机 理1.2 .1 影 响 离 子 注 入 生 物 效 应 的 主 要 因 素离 子 注 入 与Y射 线 及 宇 宙 射 线 育 种 等 都 属 于 辐 射 生 物 技 术 ， 但 在 研 究 离 子 注 入 产 生 生 物 效 应 的 因 素 中 发 现 一 些 特 异 性 : 它 既 有 能 量 沉 积 (包 括 动 量 传 递 ) ， 又 有 质 量 沉 积 和 电荷 交 换 。
简 言 之 ，在 离 子 注 入 情 况 下 影 响 因素 是 三 位 一 体 的 : 即 同 时给 生 物 体 输 入 能 量 、物 质 和 电荷 由此 可 以推 断 ，离 子 注 入 与 辐 射 存 在 质 的 差 别 ， 生 物 体 在 其 作 用 下 的 应 答 注 定 有 不 同 的 特 点 1) 能 量 传 递低 能 离 子 与 靶 原 子 的碰 撞 主 要 是 弹 性 势 能 占优 势 当 某 个 靶 原 子 通 过 碰 撞 获 得 足 够 大 的 能 量 时 ，他 将 越 过 势 垒 离 开 原 来 的 位 置 成 为 移 位 原 子 这 个 原 子 如 果 在 初 级 碰 撞 中 获 得 足 够 大 的 动 能 ，将 继 续 与 靶 原 子 碰 撞 产 生 新 的 移 位 原 子 这 样 反 复 作 用 ，可 使 注 入 离 子 径 迹 周 围 许 多 原 子 移 位 因 此 ，离 子 注 入 使 生 物 分 子 键 的 断 裂 与 离 子 (包 括 反 冲 原 子 ) 动 量 传 递 的 方 向有 关 ，而 不 像 辐 射 那 样 遵 从 “从 最 弱 的 键 开 始 断 裂 ”的 原 则 。
移 位 后 的 原 子 在 新 的 位 置 与 周 围 的 原 子 或 重 排 、或 复 合 、 或 填 隙 郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 文 献 综 述另 外 ，伴 随着 入射 离 子 能 量 沉 积 ，还 能 引起 生 物 体 表 面 二 次 粒 子 发 射 ，即溅 射 溅 射 的粒 子 可 以是 原 子 、分 子 或 碎 片 离 子 电子 溅 射 和 化 学 溅 射 可 使 生 物 体 表 面 的 分 子 碎 片 抛 射 出来 ，从 而 造 成 生 物 体 表 面 由表 及 里 的机 械 损 伤 在 电镜 下 可 观 察 到 细 胞 壁 减 薄 或 细 胞 壁 穿 孔 ， 为 离 子 束 介 导 转 基 因 提 供 了可 能 2 ) 质 量 沉 积注 入 生 物 体 的活 性 离 子 ，慢 化 后 以一 定 的几 率 与 其 周 围 的 移 位 原 子 、本 底 原 子 键 合 ，生 成 新 的 分 子 集 团 ，并 且 注 入 离 子 以高 斯 分 布 的 形 式 沉 积 下 来 ，这 就 是 质 量 沉 积 效 应 注 入 离 子 为 生 物 体 特 定 部 位 输 入 了物 质 ; 移 位 原 子 为 生 物 体 的特 定 部 位 输 入 或 输 出 了物 质 ; 而 新 形 成 的 分 子 集 团 将 参 与 到 生 物 体 包 括 遗 传 物 质 在 内 的 新 陈代 谢 过 程 中 。
这 几 种 因 素 综 合 起 来 必 将 改 变 生 物 体 某 一 微 区 内 的 分 子 结 构 、成 分 或 化 学 环 境 ，从 而 影 响 生 物 体 的基 因表 达 、修 复 等 生物 效 应 ，同 时 也 可 能 影 响D N A 的辐 射 损 伤 ，还 可 能 通 过 与D N A 或 蛋 白质 等 生 物 大 分 子 争 夺 自由基 而 起 到 减 轻 自由基 对 细 胞 损 伤 的 作 用 3) 电荷 交 换离 子 带 有 电荷 ，或 正 或 负 ，注 入 离 子 把 它 携 带 的 电荷 沉 积 在 生 物 体 表 面 的 薄 层 内 ，改 变 生 物 体 表 面 的 电性 细 胞 膜 原 是 电 的 不 良导 体 ，点 荷 在 其 表 面 的 积 累 ， 导 致 跨 膜 物 理 场 畸 变 ，影 响 了细 胞 内外 物 质 交 换 、信 息 传 递 ，从 而 影 响 生 物 体 生 命 过 程 中 的基 因 调 控 ，可 能 诱 导 出新 的修 复 机 制 ，并 且 大 量 堆 积 的 电荷 可 以 形 成一 个 弱 电场 ，从 而 激 活 生 物 体 内 的各 种 酶 ，尤 其 是 修 复 酶 ，从 而 提 高 了 修 复 损 失的 效 率 。
离 子 注 入 生 物 效 应 上 述 三 位 一 体 的 作 用 因 子 在 空 间 是 可 分 辨 的 如 果 离 子 束 聚 焦 到 微 米 以下 ，它 对 生 物 体 的损 伤 为 三 维 空 间 的 分 辨 与 辐 射 离 子 的整 体 损 伤 和 高 能 离 子 的 穿 透 作 用 是 不 同 的 另 外 ， 由于 生 物 体 具 有 极 不 均 匀 的 多 相 层 状 结 构 ， 内含 大 量 的 水 分 及 微 孔 ; 另 一 方 面 生 物 系 统 的 多 样 性 是 由基 因型 决 定 的 ，各 基 因 型 对 离 子 注 入 的 敏 感 程 度 不 同 ，引 起 的 生 物 效 应 也 不 同 更 主 要 的 是 离 子 注 入 的 能 量 、质 量 和 电荷 只 有 被 生 物 体 某 个 局 部 所 吸 收 并 达 到 某 一 阂 值 才 能 产 生 可 观 的 生 物 效 应 因 此 ，离 子 注 入 生 物 效 应 决 定 于 注 入 离 子 和 生 物 对 象 两 者 的 性 质 1.2 .2 离 子 注 入 生 物 效 应 的 进 程郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 文 献 综 述离 子 注 入 生 物 体 系 是 一 个 相 对 复 杂 的过 程 。
大 量 研 究 表 明 : 离 子 注 入 生 物 体 的存 活 曲线 不 同 于 一 般 的辐 射 [2]在 低 能 离 子 辐 射 下 ，生 物 体 的 存 活 率 剂 量 效 应 曲线 均 呈 特 殊 的 “马 鞍 形 ”， 即 随 着 辐 射 剂 量 的增 加 ， 存 活 率 呈 现 先 减 小 再 升 高 再 减 小 的 趋 势 [34 〕马 鞍 形 ’.存 活 曲线 的 出现 与 低 能 离 子 注 入 生 物 体 及 其 组 织 细 胞 的 作 用 机 理 紧 密 相 关 当 能 量 低 于 50 ke V 的 离 子 注 入 生 物 体 时 ，主 要 是 与 靶 分 子 发 生 原 子 碰 撞 转 移 能 量 ，从 而 使 其 轨 迹 附近 的 原 子 发 生 爆 发 式 电离 ，造 成 等 离 子 相 互 排 斥 而 移 位 ，产 生 一 系 列 物 理 化 学 过 程 ; 当注 入 离 子 是 生 命 必 需 元 素 的离 子 或 者 活 性 离 子 时 ，则 最 终 会 停 留在 生 物 体 内 ，与 其 他 原 子 分 子 复 合 ; 而 且 生 物 体 内存 在 大 量 生 物 通 道 ，低 能 离 子 注 入 会 导 致 表 面 某 一 薄 层 内 生 物 通 道 连 通 ，通 透 性 增 加 ，引 起 一 系 列 的 生 物 学 效 应 。
这 一 过 程 可 分 为 四 个 阶 段 :( l) 物 理 阶 段 : 是 辐 射 能 量 生 物 体 内物 质 的 最 初 过 程 发 生 时 间在 10 一‘35 内 入 射 离 子 与 靶 原 子 发 生 碰 撞 ，导 致 原 子 激 发 、 电离 ，能 量 损 失 ，同 时 慢 化 的 入 射 离 子 也 以 高 斯 分 布 形 式 沉 积 下 来 2) 物 理 化 学 阶 段 : 物 理 阶 段 产 生 的 激 发 或 电离 分 子 在 该 阶 段 自发 的 与 临 近 的 分 子 碰 撞 ，生 成 反 应 能 很 高 的 次 级 产 物 ，同 时 由于 级 联 碰 撞 仍 在 进 行 ，原 子 移 位 、‘漫化 离 子 沉 积 、扩 散 ，加 上 本 底 原 子 重 排 、化 合 ，生 成 大 量 新 的 基 团 该 段 发 生 时 间 约 在 10 一9: 内 .(3 ) 化 学 阶 段 : 上 一 阶 段 的 反 应 物 继 续 相 互 作 用 ，或 与 “环 境 ”分 子 反 应 ， 生 成 生 物 分 子 自 由基 ，直 至 形 成 稳 定 的 分 子 产 物 为 止 。
该 阶 段 持 续 10一，S在 这 个 阶 段 内 ，D A N 及 R N A 的 损 伤 开 始 ; 酶 的 激 活 或 失 活 发 生 ; 细 胞 内 琉 基 含 量 下 降 ; 脂 质 过 氧 化 开 始 ，许 多 正 常 的 生 化 反 应 收 到 干 扰 : D N A 修 复 过 程 开 始 4 ) 生 物 阶 段 : 分 子 损 伤 不 能 通 过 细 胞 的 代 谢 功 能 得 到 修 复 ，表 现 出 细 胞 死 亡 、 细 胞 突 变 以及 离 子 注 入 后 质 量 的 沉 积 可 能 使 D N A 分 子 的 结 构 成 分 被 取 代 或 补 充 ， 由此 导 致 遗 传 性 变 异 该 阶 段 持 续 的 时 间 从 几 秒 到 若 干 年 不 等 大 量 的 研 究 结 果 表 明 ，在 低 能 离 子 注 入 生 物 体 后 所 表 现 的 生 物 学 效 应 具 有 局 部 性 、双 重 性 和 不 易 修 复 性 [5J1.3 离 子 注 入 技 术 在 微 生 物 领 域 的应 用 实 例20 世 纪 90 年 代 ，低 能 离 子 注 入 技 术 逐 渐 应 用 于 工 业 微 生 物 的 选 育 ，与 植 物 离郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 文 献 综 述子 注 入 诱 变 相 比 ，虽 然 起 步 稍 晚 ，但 在 工 业 微 生 物 的 菌 种 选 育 以及 其 机 理 研 究 方 面 已经 有 重 大 突 破 ，并 通 过 部 分 菌 种 的 推 广 ，促 进 了我 国 发 酵 工 业 的 发 展 ，产 生 了 明 显 的 经 济 效 益 ，取 得 了令 人 鼓 舞 的 成 果 。
总 体 来 说 工 业 微 生 物 注 入 育 种 的 工 作 主 要 集 中在 以下 几 个 方 面 :1.3 .1 在 维 生 素 菌 种 选 育 中 的 应 用虞 龙 等 {6]则 利 用 H +、丫 、Ar+ 注 入 巨大 芽 抱 杆 菌 (召a eizzu: m e罗 teriu) ，确 立 了最 佳 离 子 注 入 剂 量 ，选 育 出4 株 菌 株 进 行 工 业 化 生 产 180 m 3、30 0 m 3发 酵 罐 30 批 次 的 实 际 生 产 中 ，平 均 糖 酸 转 化 率 (克 分 子 )为 9 1% ， 比 出 发 菌 株 高11% ， 提 高 了 生 产 效 率 ，降低 了成 本 ，增 强 了我 国V c产 品在 国 际 上 的 竞 争 力 p一胡 萝 卜 素 是 一 种 优 良的 色 素 ，在 人 体 和 动 物 体 内可 以转 化 为v A ， 张 宁 等 [7] 10 ke v N +注 入 p一胡 萝 卜素 生 产 菌 三 抱 布 拉 霉 (B ja ke:了ea tri sP ora) ，筛 选 得 到 2 株 产 量 比 出 发 菌 株 高20 % 且 遗 传 性 能 稳 定 的 菌 株 ，使 p一胡 萝 卜素 的产 量 达 到 2 .2 s/L 。
王 岁 楼 等 [81用N +注 入 红 酵 母 (R ho do torul) N-R 06 ， 获 得 一 株 产 类 胡 萝 卜素 高 且 遗 传 性 能 稳 定 的 突 变 株 L1 5 ，使 p一胡 萝 卜素 产 量 达 8.Om g/L ， 比 出 发 菌 株 高 34.5 % 1.3 .2 在 抗 生 素 高 产 菌 种 选 育 中 的 应 用抗 生 素 是 微 生 物 细 胞 的 次 级 代 谢 产 物 ， 目前 主 要 采 用 微 生 物 发 酵 法 进 行 合成 由于 抗 生 素 产 量 的 高 低 受 微 生 物 多 步 代 谢 调 控 的 影 响 ，选 育 高 产 菌 株 很 困难 向砒 等 l9]利 用 离 子 注 入 壮 观 链 霉 菌 (str eP tino my ce: sP octab ilis)lo43 ，选 育 出 的 突 变 菌 株 产 壮 观 霉 素 的 效 价 比 出 发 菌 株 提 高 了 102 ，3 % 钱 修 萍 等 【’0〕以产 氨 短 杆 菌(co 尽ne ba cte riu m am o on iage ne ，) 心 3 为 出 发 菌 株 ，采 用 矿 注 入 诱 变 ，最 终 获 得 了 尿 普 酸 高 转 化 突 变 菌 株 K U 一F 14 一14 。
突 变 菌 株 生 物 转 化 生 产 尿 普 酸 的 能 力 约 为 90 0 m g/L ，比 出 发 菌 株 提 高 161 .6 % 贺 亚 男 等 [川用 矿 注 入 绿 链 霉 菌 (str eP tomy ce:virido ch r0 0 0ge n es)SV 一 1 ，最 终 获 得 了产 阿 维 拉 霉 素 达 83 ‘sm s/L 、较 出 发 菌 株 提 高 19 5% 的 突 变 株 S V T- 4 5 1，3 .3 在 酶 制 剂 菌 种 选 育 中 的 应 用赵 从 等 f12]对 产 中 性 蛋 白酶 的 枯 草 芽 抱 杆 菌 (丑a cizzu，、u b tilis) 且5 1.3 9 8进 行N 十注 入 诱 变 ，筛 选 出 的 高 产 菌 株 z C 一7 ，其 酶 活 力 最 高 可 达 19 ，68 OU /m l，为 初 始 菌 株 的2 .1倍 赵 彩 艳 等 【’3]用 N+ 注 入 诱 变 黑 曲霉 (A sP ergillus n ige : ) 菌 株 Y 2 4 4 9 ，筛 选 出 了 高 产 菌 株 S D 16 。
其 产 p一葡 聚 糖 酶 的 酶 活 力 由 出 发 菌 株 的 73 .00 U /m l提 高 到郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 文 献 综 述了4 93 .24u /m l，产 量 提 高 7倍 李 市 场 等 !’4〕用 N ~注 入 诱 变 木 聚 糖 酶 产 生 菌 黑 曲霉A 3 ， 筛 选 出 了 高 产 菌 株 N Z 12 ，其 产 酶 量 达 到 6 00 川 /m L .1.3 .4 在 有 机 酸 菌 种 选 育 中 的 应 用古 绍 彬 等 !”〕采 用 离 子 束 诱 变 方 法 对 米 根 霉 (R h 七op u: ) 进 行 改 良，获 得 高 产 L 一乳 酸 菌 株 P E 33 o3 ，产 酸 能 力 较 原 始 菌 株 提 高 75 % ，达 到 140 9/L 周 小 楠 等 [’6]用 lokev N 十对 L 一乳 酸 产 生 菌 华 根 菌 (天人行叩 u: 人sn ensi: ) 进 行 诱 变 ，筛 选 得 到 了遗 传 稳 定 性 能 好 且 L 一乳 酸 产 量 比 出发 菌 株 高 17% 的 突 变 株 ，使 L 一乳 酸 的 产 量 达 到 33 .79 /L 。
1.3 .5 在 其 它 菌 种 选 育 中 的 应 用脂 肤 类 生 物 表 面 活 性 剂 具 有 抗 菌 活 性 ，能 够 抗 细 菌 、真 菌 、病 毒 以及 支 原 体 ，在 生 物 医 药 领 域 具 有 重 要 的 应 用 价 值 I’7一2‘】 方 传 记 等 [22〕用 N +注 入 淀 粉 液 化 芽 抱 杆 菌 (刀acizzus a柳 2021叮uefa cien: ) E s 一2 ，获 得 了一 株 抗 菌 肤 高 产 菌 ，使 脂 肤 含 量 提 高 了 巧 .2 % 国外 学 者 发 现 美 伐 他 汀 (M evasatin ) 可 抑 制 C aC o 结 肠 癌 细 胞 、H L 一60 急 性 髓 系 白血 病 细 胞 及 J王呵一3 多 发 性 骨 髓 瘤 细 胞 等 细 胞 增 殖 ， 诱 导 凋 亡 [23〕 张 莉 等 [2#] 用 N 十诱 变 的 方 法 筛 选 到 一 株 美 伐 他 汀 高 产 菌 株 ， 发 酵 单 位 比 出 发 菌 株 提 高 3 5 % ， 且 遗 传 性 能 稳 定 王 鹏 银 等 [25]用 N +注 入 酒 精 酵 母 (sa ce八a ro哪 ce: 。
erevisia e)A Y 一 15 ，最 终 获 得 1株 亮 氨 酸 缺 陷 型 茵 株 A 71 3 ，与 出发 茵 株 相 比 ，该 菌 株 异 戊 醇 降 低 3 9 .85 % ，高 级 醇 总 量 降 低 33 .62 % ， 发 酵 性 能 基 本 保 持 不 变 通 过 耐 性 试 验 表 明 ，A 7 13 耐 酒 精 度 达 18 % ， 耐 盐 度 为 14 % 此外 ，离子束 介导转 基 因对 微生物 的机 理 也在研究 中宋道 军等126味U用 离 子 束 介 导 的转 基 因 方 法 把 耐 辐 射 球 菌 的D N A 片 段 导 入 大 肠 杆 菌 紫 外 线 敏 感 菌 株 内 ，提 高 了其 D N A 损 伤 修 复 能 力 ，从 而 证 明 离 子 束 介 导 转 基 因 不 仅 适 合 于 植 物 细 胞 ， 对 微 生 物 细 胞 也 是 可 行 的 离 子 束 生 物 技 术 是 菌 种 选 育 的 新 方 法 ，并 已被 生 产 实 践 证 明 是 一 种 行 之 有 效 的 微 生 物 菌 种 选 育 的 方 法 ，也 是 一 种 不 可 替 代 的 育 种 方 法 ，对 我 国微 生 物 育 种 水 平 的 提 高 有 着 重 要 意 义 ，这 一 创 新 技 术 如 果 能 尽 快 在 国 内 的 微 生 物 育 种 科 研 单 位 及 企 业 得 到 推 广 ， 将 加 快 我 国 的 微 生 物 育 种 水 平 早 日赶 超 世 界 先 进 水 平 的 步 伐 。
郑 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 文 献 综 述2 原 生 质 体 诱 变 技 术 在 微 生 物 育 种 中 的应 用2 .1 原 生 质 体 诱 变 技 术 概 述原 生 质 体 的概 念 最 初 起 始 于 植 物 细 胞 生 物 学 ，19 52 年 由 S al T on 引 入 到 微 生 物 学 中 ，195 3 年 We ibull 等 首 次 用 溶 菌 酶 处 理 巨大 芽 抱 杆 菌 (B ac illus m ega teI’ium ) 得 到 原 生 质 体 ，并 首 先 提 出 原 生 质 体 在 微 生 物 学 中 的 概 念 细 胞 壁 被 酶 水 解 剥 离 后 ，剩 下 由 原 生 质 膜 包 围 的 原 生 质 部 分 称 为 原 生 质 体 19 83 年 儿 m 等 [27}首 次 诱 变 玫 瑰 色 小 单 抱。