第三章 培养基的配制及灭菌一、培养基及其作用：是向植物细胞提供营养的场所其作用是向植物细胞提供所需的各种营养；调节渗透压、酸碱度；供给水分固体培养基还起着支撑作用 培养基多以命名人的名字命名目前，比较流行的培养基有：v MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；v B5培养基，其特点是含有较低的铵；v White培养基，其特点是无机盐低，适于生根；v N6培养基，其特点是KNO3和(NH4)2SO4含量较高，适于花药培养； v KM8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养 二、培养基的成分：主要可以分水、 无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类 1、水：植物原生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒 大规模生产时可用自来水但在少量研究上尽量用蒸馏水，防止贮藏过程发霉变质无机元素：大量元素，指浓度大于0.5mmol/l的元素，有N、P、K、Ca、Mg、S等其作用是：(1) 氮：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾等有时，也添加氨基酸来补充氮素 (2) 磷：是生物膜、核苷酸（ 如ATP）、核酸的重要组成部分常用于培养基的磷化物有H 2PO4或aH2PO4等。
(3) 钾：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供4) Mg、S和Ca： Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂； S是含S蛋白质的组成成分它们常以MgSO47H2O提供 Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供 (5) 微量元素：指小于0.5mmol/l的元素，Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等Fe是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分在制做培养基时常用FeSO47H2O和a2-EDTA结合成螯合物使用B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常 这些整株植物生长所必需的营养元素，对于植物组织培养来说也是必需的当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长 3、有机化合物：培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。
常加入的有机成分主要有以下几类：(1) 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长 (2) 维生素(Vitamin)：维生素类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用主要有： VB1 (盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要作用 VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长 VPP(烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系 VC(抗坏血酸)：有防止组织变褐的作用 (3) 肌醇：又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用用于构建细胞壁使用肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、 分化有促进作用4) 氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用培养基中常用甘氨酸有时用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它们营养丰富，极易引起污染如在培养中无特别需要，以不用为宜 (5) 天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用椰乳：它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用香蕉：主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用马铃薯：添加后可得到健壮的植株。
水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸其它：酵母提取液、麦芽提取液等 4、植物激素：在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质， 对植物组织培养起着决定性作用1) 生长素类：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长 IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低,是生长素中活力最弱的激素， 对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解 NAA(萘乙酸) 在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成， 耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍 IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质 2,4-D（2,4二氯苯氧乙酸）起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高， 但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育 生长素配制时可先用少量95酒精助溶2, 4-D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用 (2) 赤霉素(GA)：培养基中添加的是GA3，主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。
一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长 赤霉素溶于酒精，配制时少量可用95酒精助溶赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70100失效，应当采用过滤灭菌法加入 (3) 细胞分裂素类： 这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(激动素)、ZT(玉米素)等其中ZT活性最强，但非常昂贵常用的是6-BA 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长 促进细胞分裂与扩大 抑制根的分化 因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用 5、培养材料的支持物(1) 琼脂：在固体培养时琼脂是最好的固化剂固体培养基利于组织置于培养基表面琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养2) 其它：有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小 、抗生物质：抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/l之间添加抗生物质可防止菌类污染 7、抗氧化物：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。
这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡 v抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用50200mg/l的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫氨基甲酸酯等 8、活性炭：活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大它可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛 v茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于VC和半胱氨酸v在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长v活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关 v在使用活性炭时，要注意其吸附有害物质和吸附生长调节物的二重性，尤其是当较高的活性炭足以能抵消生长调节物的作用时，应注意调整好活性炭与生长调节物等培养基成分的用量，使其皆能发挥作用在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。
二、母液的配制和保存1、所谓母液是欲配制液的浓缩液，这可保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，并便于低温保藏 一般配成比所需浓度高10100倍的母液 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等 v配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液即配成：v大量元素10倍液，定容至1000ml；v微量元素100倍液，定容至1000ml；v铁盐100倍液，定容至1000ml；v维生素1mg/l，定容至100ml；v激素1mg/l，定容至50100ml 2、配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如a 2和SO4 2 ，a 2 、g 2和PO4 3一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水药品应选取等级较高的化学纯或分析纯药品的称量及定容都要准确各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合 3、一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释 1、MS培养基母液的制备 2、 MS培养基的配制 上述内容见实验指导：实验二、实验三 三、 MS培养基的分装与灭菌 1、培养基分装到100ml的培养瓶中，用量一般为每瓶3040ml，过多造成浪费，过少则不利于植物的生长。
2、培养基的灭菌：（1）灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死 消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物 v这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物菌的特点是：极小，肉眼看不见无处不在，无时不有，无孔不入在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生 v无菌的范畴是：v经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体v经其它物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)v高层大气、岩石内部v健康的动、植物的不与外部接触的组织内部v强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多 2、常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类： 物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用 1、培养基用湿热灭菌：培养基在制备后的24h内完成灭菌工序 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟 v对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间 v对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌2030minv高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.20.3 单位v高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压 在820蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍 v培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使1525的蔗糖水解为葡萄糖和果糖培养基pH值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1活性碳时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1活性碳，蔗糖水解率可达5 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：(1) 经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。
2) 设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等 (3) 配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序如将磷、钙和铁放在最后加入4) 注意高压灭菌后培养基pH的变化及回复动态如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48而96h后又回降至5.8左右这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握 2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌4、不耐热的物质采用过滤灭菌5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌 实验二 培养基（MS）母液的配制【目的】 (5分) 了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导准备培养基原理】 (15分) 对植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等培养基的主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等 配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液。
【实验用品】 (10分)1器具：电子天平、冰箱、pH试纸、烧杯、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶2试剂：硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氮酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、肌醇、2,4-D、6-BA、 1 molL盐酸、1 molL氢氧化钠 【实验方法】 (30分，含操作过程)1MS培养基母液配制1）、大量元素母液配制(1) 按培养基配方(表2-1)所列大量元素成分(NH4N03、KN03、KH2PO4、MgSO47H2O和CaCl22H2O)，取相应的分析纯化学试剂2) 将1 L培养基所需各种大量元素扩大10倍，分别用100 mL烧杯，在电子天平上进行实际称量 (3) 在盛有1种元素的烧杯中，加入约10mL蒸馏水，放置在磁力搅拌器上充分溶解后转至另一烧杯中按同样步骤分别溶解各种大量元素后，与第1种大量元素溶液混合4) 混合液倒人1000 mL容量瓶中定容后，转入试剂瓶中，贴上标签(注明配制时间、扩大培数、配制人员姓名)，母液贮存于24的冰箱中 微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液的配制由老师负责。
【思考题】1、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？(10分)2、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜浓度范围？(10分)3、配制培养基母液时应注意什么问题？(10分)4、怎样进行培养基的湿热灭菌？(10分) 实验三 培养基（MS）配制与灭菌【目的】（2分）学习培养基配制与灭菌方法【原理】 （15分） 凡是暴露在(未经处理的)空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体都是有菌的培养基中含有大量的有机物，特别是含糖量较高，是微生物滋生、繁殖的极好场所而接种材料需要在无菌得件下培养很长的时间，如果培养基被微生物所污染，便达不到培养的预期结果 因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节培养基灭菌的方法有多种，本实验田采用高压蒸气灭菌法（即湿热灭菌原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在0.10MPa的压力下，锅内温度达121在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢 【实验用品】 （3分）1器具：台秤、烧杯、量筒、三角瓶、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒、玻璃铅笔、pH值试纸、洗耳球、线绳、包头纸、石棉网、洗瓶2试剂：蔗糖、琼脂、1N NaOH、1N HCl、各种培养基母液。
【实验方法】 （50分，含操作）1培养基配制本实验以6人为一大组，按500ml容量一组配制培养基 1) 首先洗净盛装培养基的容器，烘干或自然晾干； (2) 按照下面公式，计算需配制培养基的量，然后根据各种母液扩大的倍数，计算从母液中吸取的毫升量吸取量(mL)=需要配制培养基的体积(mL)需要配制浓度(mgL)母液浓度(mgL) (3) 用1个100 mL烧杯，分别从各种母液吸取用量，加入蔗糖15g (4) 称取琼脂5 g，置于1个1000 mL烧杯中，加蒸馏水100 mL，在电炉上加热溶解5) 将100 mL的琼脂溶化液和100 mL培养基成分充分混合，定容至500 mL，1N NaOH或1N HCl将pH值调至5.8，以40 mL瓶分装至培养瓶中6) 封好瓶，在标签上写明培养基代号 2培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌法：把分装好的培养基及所需灭菌的各种用具、蒸馏水等，放入高压灭菌锅的消毒桶内，加水至高水位盖好锅盖，上好螺丝，关闭放气阀通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，在122124下保持1520 min，即可达到消毒目的。
高压蒸气灭菌注意事项：（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽然达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在并达不到应有的温度，因而影响灭菌效果在实际操作过程中常压力上升到0.05MPa时排2次气（2）当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果3）培养瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100时，培养基会喷溢，造成培养基瓶壁和包头纸的污染 制备好的培养基应保存在225避光的环境，有条件置冰箱48冷藏储存较好培养基若保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用 【思考题】 （30分）1、灭菌和消毒有无差别？为什么？2、常用的灭菌方法各有哪些优缺点？3、采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项？ 。