生物工程下游分离与纯化生物工程下游分离与纯化让我们从两个实例说起让我们从两个实例说起白色结晶体粉末无臭，无味水难溶，溶于氯仿、丙酮白色结晶体粉末无臭，无味水难溶，溶于氯仿、丙酮紫杉醇主要适用于紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌卵巢癌和乳腺癌，对，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效也都有一定疗效1963年美国化学家瓦尼从美国西部大森林年美国化学家瓦尼从美国西部大森林 太平洋杉（太平洋杉（Pacific Yew）也叫短叶）也叫短叶红豆杉红豆杉树皮和木材分离得到树皮和木材分离得到从红豆杉中如何获得的呢？从红豆杉中如何获得的呢？树皮树皮粉碎粉碎-85-95%酒精酒精-35-55热回流浸提热回流浸提三次三次-50-70真空减压浓缩真空减压浓缩-氯仿氯仿萃取萃取-得得1%氯仿膏氯仿膏-氯仿完全溶解氯仿完全溶解-硅胶搅拌均匀硅胶搅拌均匀-干燥干燥-过筛过筛-装装层析柱层析柱-氯仿氯仿-甲醇梯度洗脱甲醇梯度洗脱-浓缩浓缩-得得58%半成品半成品-丙酮溶解丙酮溶解-硅胶搅拌硅胶搅拌均匀均匀-干燥干燥-过筛过筛-装层析柱装层析柱-丙酮石油醚梯度洗脱丙酮石油醚梯度洗脱-浓缩浓缩-得得2025%半成品半成品-丙酮丙酮-石油醚石油醚-结晶结晶34次次-抽滤抽滤-50真空减压干燥真空减压干燥-得得7580%半成品半成品-16Mpa压力层析分离压力层析分离-浓缩浓缩-丙酮石油醚结晶丙酮石油醚结晶-抽滤抽滤-干燥，得干燥，得995%成品。
成品严谨而复杂的分离纯化过程！严谨而复杂的分离纯化过程！发酵培养发酵培养1个月个月20-25紫杉醇发酵液紫杉醇发酵液预处理预处理过滤过滤滤液滤液萃取萃取收集有机物收集有机物或纳滤浓缩或纳滤浓缩45减压蒸发减压蒸发紫杉醇粗提物紫杉醇粗提物大孔吸附树脂大孔吸附树脂脱色提取脱色提取80%乙腈乙腈洗脱洗脱硅胶柱层析硅胶柱层析（去除酯、蜡等杂质）（去除酯、蜡等杂质）高纯度紫杉醇高纯度紫杉醇正己烷结晶正己烷结晶真空干燥真空干燥 40紫杉醇晶紫杉醇晶体体等体积萃取液等体积萃取液 氯仿：甲醇氯仿：甲醇=10:1内生真菌内生真菌冷冻离心冷冻离心3min8-12h严谨而复杂的分离纯化过程！严谨而复杂的分离纯化过程！是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一它通过将体内血液引流是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一它通过将体内血液引流至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的电解质溶液（透析液）在一根根空心纤维内外，通过弥散电解质溶液（透析液）在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换对流进行物质交换，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分，并将经过净化的血液回输的整个过程称为血液透析。
并将经过净化的血液回输的整个过程称为血液透析严谨而复杂的清除代谢废物过程！严谨而复杂的清除代谢废物过程！从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化出目的出目的 产物产物或者分离清除出或者分离清除出代谢废物代谢废物的过程至关重要！的过程至关重要！生物技术专业还开设一门课称为生物技术专业还开设一门课称为生物过程下游工艺生物过程下游工艺生物制品生产过程示意图本课程解决的问题本课程解决的问题-下游技术下游技术上游过程发酵液发酵液/天天然动然动/植物植物预处理预处理固液分离固液分离细胞破碎细胞破碎细胞碎细胞碎片分离片分离胞外产物胞外产物初步纯化初步纯化高度纯化高度纯化产品及包装加工产品及包装加工均均质质超超声声研研磨磨溶胞溶胞沉降沉降过滤过滤离心离心粉碎粉碎/加加热热溶解溶解/调调pHpH絮凝或凝聚絮凝或凝聚再凝聚等再凝聚等离心分离离心分离萃萃 取取过过 滤滤沉沉 淀淀吸吸 附附萃萃 取取膜膜过滤过滤吸附色吸附色谱谱分配色分配色谱谱离子交离子交换换凝凝胶胶色色谱谱亲亲和色和色谱谱液相色液相色谱谱无菌过滤无菌过滤超超 滤滤冷冻干燥冷冻干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥结结 晶晶生物分离的一般过程生物分离的一般过程What?课程基本内容 1.生物工程下游技术的特点和一般流程生物工程下游技术的特点和一般流程 2.生物样品的预处理生物样品的预处理（凝聚、絮凝、沉降、过滤、离心（凝聚、絮凝、沉降、过滤、离心）3.膜分离技术膜分离技术(微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、透析等）微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、透析等）4.色谱分离技术色谱分离技术（吸附（吸附/分配分配/离子交换离子交换/凝胶凝胶/亲和）亲和）5.离子交换与吸附离子交换与吸附（阳离子交换、阴离子交换、吸附分离）（阳离子交换、阴离子交换、吸附分离）6.萃取技术萃取技术（溶剂溶剂/双水相双水相/超临界）超临界）7.电泳技术电泳技术（等电聚焦（等电聚焦/毛细管电泳毛细管电泳/制备电泳）制备电泳）8.生物样品的精制生物样品的精制浓缩结晶干燥浓缩结晶干燥 生物工程产品的特点 产物在初始物料中的含量低产物在初始物料中的含量低（氧传递限制；细胞量；产氧传递限制；细胞量；产物抑制物抑制）初始原料的组成成分复杂初始原料的组成成分复杂（大分子大分子;小分子小分子;可溶物可溶物;不可不可溶物溶物;化化 学添加物）；学添加物）；产品中有时含有微生物的细胞、代谢产物、残留培养基；产品中有时含有微生物的细胞、代谢产物、残留培养基；生物活性物质的稳定性差生物活性物质的稳定性差（对（对pH、温度、金属离子、有、温度、金属离子、有机溶剂、机溶剂、剪切力、表面张力等都十分敏感，易失活变性）；剪切力、表面张力等都十分敏感，易失活变性）；生物发酵产品种类繁多，产物的分子量、结构、性质等生物发酵产品种类繁多，产物的分子量、结构、性质等往往差异往往差异 很大；很大；质量要求高质量要求高(许多产品用作医药、食品、试剂等许多产品用作医药、食品、试剂等)。
生物工程下游分离过程的特点 满足维持生物物质活性的要求满足维持生物物质活性的要求 满足快速分离的要求满足快速分离的要求 满足纯度和杂质去除的要求满足纯度和杂质去除的要求 满足高效分离的要求满足高效分离的要求 满足成本优化的要求满足成本优化的要求生物分离的经济性(1)生物分离至少占总成本生物分离至少占总成本50%(2)降低废物排放降低废物排放（有时甚至产品：废物（有时甚至产品：废物=1:3250)(3)工艺改造工艺改造分离工程研发费用与成本分离工程研发费用与成本 研究费用：研究费用：50%以上以上 产品成本：产品成本：40-80%人力物力：人力物力：70-90%因此，生物工程下游技术不可忽视！因此，生物工程下游技术不可忽视！生物分离纯化需满足的要求具体化 操作条件必须温和，特别是对具有生物活性的物质，在操作条件必须温和，特别是对具有生物活性的物质，在后处理过后处理过 程中必须保持其生物活性；程中必须保持其生物活性；分离纯化技术的选择性和专一性强，能从复杂的混合物分离纯化技术的选择性和专一性强，能从复杂的混合物中有效地中有效地 将目的产物分离出来，达到较高的分离纯化倍数；将目的产物分离出来，达到较高的分离纯化倍数；目的产物的量和活性具有较高的收率；目的产物的量和活性具有较高的收率；在提高单个分离技术效率的同时，注意各单元操作间的在提高单个分离技术效率的同时，注意各单元操作间的整体协整体协 调，工艺步骤尽可能的少；调，工艺步骤尽可能的少；整个过程快速。
整个过程快速分离纯化路线包括两个基本阶段 产物的初级分离阶段产物的初级分离阶段初级分离阶段初级分离阶段在细胞培养结束之后，主要是分离细胞和培养液、破碎细在细胞培养结束之后，主要是分离细胞和培养液、破碎细胞释放产物（如胞内酶），溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和胞释放产物（如胞内酶），溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除去除大部分杂质大部分杂质等产物的纯化精制阶段产物的纯化精制阶段纯化精制阶段纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用各种高选择性的技术手段，是在初级分离的基础上，用各种高选择性的技术手段，将将 目的产物和干扰杂质尽可能地分开目的产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求使产物的纯度达到相关的要求活性物质分离纯化工艺选择原则 质量原则：质量原则：保证产品的高质量，一是所选择的分离纯化方法要有利于最保证产品的高质量，一是所选择的分离纯化方法要有利于最大程度的去除杂质二是在分离纯化过程中要防止生物活性物质的降解大程度的去除杂质二是在分离纯化过程中要防止生物活性物质的降解失活收率原则：收率原则：工艺条件优化时，必须考虑收率的最大化收率与纯度是一工艺条件优化时，必须考虑收率的最大化。
收率与纯度是一对矛盾体，通过工艺优化研究可以使收率与纯度都达到最佳值对矛盾体，通过工艺优化研究可以使收率与纯度都达到最佳值时间原则时间原则：一是掌握生物活性物质稳定性的时间；二是工艺路线设计时：一是掌握生物活性物质稳定性的时间；二是工艺路线设计时各单元操作所需时间的匹配，尽量节省时间各单元操作所需时间的匹配，尽量节省时间生物分离纯化的基本策略下游分离纯化工作前的准备：下游分离纯化工作前的准备：全面的调查分析全面的调查分析，充分地论证；准备充，充分地论证；准备充足的实验和生产设备足的实验和生产设备提取工艺：提取工艺：尽可能选择简单的提取工艺尽可能选择简单的提取工艺 分离纯化步骤：分离纯化步骤：原材料的预处理原材料的预处理 颗粒性杂质的去除颗粒性杂质的去除固液分离固液分离（离心法、过滤法）（离心法、过滤法）可溶性杂质的去除和目标产物的初步纯化可溶性杂质的去除和目标产物的初步纯化（选择性沉淀、膜过滤、（选择性沉淀、膜过滤、选择性吸附以及萃取等技术，去除与目标产物混溶的可溶性杂质；必选择性吸附以及萃取等技术，去除与目标产物混溶的可溶性杂质；必要时采用集成分离技术）要时采用集成分离技术）目标产物的精制目标产物的精制（如：层析法和电泳法）（如：层析法和电泳法）工艺放大策略工艺放大策略：小试中试大规模生产小试中试大规模生产生物分离技术与化工分离技术的区别 化工分离技术：化工分离技术：获得纯的化学物质获得纯的化学物质 生物分离技术：生物分离技术：在得到纯的生物物质同时，还必须关注特定杂质的去在得到纯的生物物质同时，还必须关注特定杂质的去 除；同时保持其除；同时保持其生物活性生物活性 与传统的化学试剂的纯度概念不同与传统的化学试剂的纯度概念不同，生物产物对有害物质有严格的控制，生物产物对有害物质有严格的控制，生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许有极微量的有害生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许有极微量的有害杂质存在。
杂质存在生物分离与纯化技术的发展前景技术应用生物产品的竞争优势最终归结为生物产品的竞争优势最终归结为低成本和高纯度低成本和高纯度因此，因此，简化工艺、降低成本和提高质量是生物分离与纯化技术的发展方向简化工艺、降低成本和提高质量是生物分离与纯化技术的发展方向1.研究和开发新型和经济高效的分离纯化技术研究和开发新型和经济高效的分离纯化技术(1)新型分离介质的研制新型分离介质的研制色谱分离介质色谱分离介质(2)膜分离技术的推广应用膜分离技术的推广应用(3)提高分离过程的选择性提高分离过程的选择性：应用分子识别原理，利用生物亲和作用的高度特异性，结合已有分：应用分子识别原理，利用生物亲和作用的高度特异性，结合已有分离技术：亲和层析、亲和膜分离、双水相萃取、反胶团萃取、离技术：亲和层析、亲和膜分离、双水相萃取、反胶团萃取、亲和沉淀、亲和色谱、亲和电泳亲和沉淀、亲和色谱、亲和电泳等等(4)强化分离过程的研究强化分离过程的研究机理研究机理研究：综合运用化学、工程、生物、数学、计算等多学科知识：综合运用化学、工程、生物、数学、计算等多学科知识和工具，学科交叉，实现新突破和工具，学科交叉，实现新突破2.生物工程上游技术与下游技术相结合生物工程上游技术与下游技术相结合3.通过上游工艺条件优化，减少非目的产物通过上游工艺条件优化，减少非目的产物eg.半透膜发酵罐；发酵罐中加入吸附树脂半透膜发酵罐；发酵罐中加入吸附树脂总之：进一步研究和开发高效、低成本的分离与纯化技术必将推动生物技术产业的发展总之：进一步研究和开发高效、低成本的分离与纯化技术必将推动生物技术产业的发展 细胞破碎技术研研 磨磨 机械法与非机械法比较机械法与非机械法比较 例3.超滤膜分离原理示意图（2）依据被分离物质的体积大小及与膜的亲和性而得到分离依据被分离物质的体积大小及与膜的亲和性而得到分离中空纤维超滤膜组件中空纤维中空纤维UF膜特点膜特点 清洗性好清洗性好 均匀微孔分布均匀微孔分布 纤维内径多种规格纤维内径多种规格 膜内部阻力小膜内部阻力小卷式反渗透膜组件及不对称膜结构膜分离技术应用举例膜分离过程在生物工程中的应用电渗析分离 透析（Dialysis,D)渗 析 液原 料 液溶 剂渗 出 液溶 剂溶 质依浓度差传递低分子量依浓度差传递低分子量溶质，截留高分子量溶溶质，截留高分子量溶质的过程。
质的过程膜孔小膜孔小 例1.凝胶渗透色谱的分离原理 依据被分离物质体积大小不同而分离依据被分离物质体积大小不同而分离 例2.离子交换色谱的分离过程 利用被分离物质与离子交换树脂的亲和性不同而得到分离利用被分离物质与离子交换树脂的亲和性不同而得到分离萃取技术色谱分离法Petroleum etherC aC O 3M ixture 泵泵 混合器混合器 层析柱层析柱 检测器检测器 记录仪记录仪 分部收集器分部收集器检测器：吸光度、荧光、折射率、化学发光、电导率等实例1：聚谷氨酸的分离纯化-聚谷氨酸（聚谷氨酸（-PGA）结构结构：D-/L-谷氨酸，谷氨酸，-酰胺键，酰胺键，1-100万万 性质性质：水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、对人类和环境无毒无害：水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、对人类和环境无毒无害PGA应用领域应用领域药药物物缓缓释释保保水水剂剂吸吸水水剂剂保保湿湿剂剂增增稠稠剂剂絮絮凝凝剂剂-PGA医药医药农业农业环环境境食食品品化妆品化妆品其其他他微滤：右侧为外压式中空纤维滤膜，孔径为0.2m，用于除去发酵液中的菌体超滤：左侧为内压式中空纤维滤膜，透过孔径约为10-100nm。
而聚谷氨酸的重均分子量为30万左右，所以通过超滤可以除去发酵液中的小分子蛋白和糖类等杂质；同时实现浓缩微滤去除菌体，超滤去除小分子杂质微滤去除菌体，超滤去除小分子杂质 通过上一步的浓缩过滤，发酵液的体积可以减少数十倍，此时加入四倍体积的无水乙醇，沉淀得到PGA浓缩液醇沉浓缩液醇沉-离心离心-透析透析-冷冻干燥冷冻干燥 得到产物得到产物将沉淀离心，利用透析袋进一步除去小分子物质，然后进行冷冻干燥，得到相对纯净的产品实例2-凝胶色谱法分离单壁碳纳米管 单壁碳纳米管（单壁碳纳米管（SWCNTs）是由碳原子形成的石墨片层卷成的无缝、中空是由碳原子形成的石墨片层卷成的无缝、中空的管体，可包含一层到上百层石墨层的管体，可包含一层到上百层石墨层是一种具有战略意义的是一种具有战略意义的新兴材料新兴材料，它在复合材料、平板显示器、生物传感，它在复合材料、平板显示器、生物传感器、抗电磁干扰材料等方面有广阔的应用前景器、抗电磁干扰材料等方面有广阔的应用前景目前分离单壁碳纳米管的方法目前分离单壁碳纳米管的方法：双向电泳、超速离心等：双向电泳、超速离心等 主要问题主要问题:产量低、费用高产量低、费用高 多级凝胶色谱法：多级凝胶色谱法：基于基于SWCNTs 不同手性结构组分与烯丙基葡聚糖凝胶不同手性结构组分与烯丙基葡聚糖凝胶之间相互作用强度不同而实现分离之间相互作用强度不同而实现分离预实验研究单壁碳纳米管与色谱填料的相互作用 Figure 1|Effect of overloading single-wall carbon nanotubes(SWCNTs)on gel columns.请看视频请看视频不同加载量的SWCNT原液及色谱分离效果（视频说明）v 2根色谱柱，填充相同量（根色谱柱，填充相同量（1.4 ml）的烯丙基葡聚糖填料，柱）的烯丙基葡聚糖填料，柱1、柱、柱2分别加分别加入入1 ml和和8 ml分散于分散于2 wt%SDS水溶液的水溶液的SWCNT原液原液v 用用2 wt%低浓度低浓度SDS洗脱非结合的洗脱非结合的SWCNT，得到，得到2种种不同颜色的色谱柱：不同颜色的色谱柱：柱柱1上紫下蓝；柱上紫下蓝；柱2为均匀紫色。
为均匀紫色v 再分别注入高浓度（再分别注入高浓度（5 wt%）SDS溶液，洗脱掉结合在色谱填料上的溶液，洗脱掉结合在色谱填料上的SWCNT，柱，柱1为蓝色；柱为蓝色；柱2为紫色v 可见，不同结构的可见，不同结构的SWCNT可以选择性地吸附在该凝胶色谱填料上，并由可以选择性地吸附在该凝胶色谱填料上，并由于相互作用强度的不同而实现分离于相互作用强度的不同而实现分离色谱分离方法与结果多种不同手性结构组分SWCNT分离原理示意图得到不同组分的吸收光谱得到的每种组分再重复进行上述凝胶色谱分离过程，便可得到各种不同手性组分和含量的分级产物重复上述凝胶色谱过重复上述凝胶色谱过程分离得到分级产物程分离得到分级产物凝胶色谱分离单壁碳纳米管的优点及资料来源 本研究依据不同组分单壁碳纳米管与烯丙基葡聚糖凝胶介质之间的相互本研究依据不同组分单壁碳纳米管与烯丙基葡聚糖凝胶介质之间的相互作用强度不同，实现产物多组分的分离作用强度不同，实现产物多组分的分离 该方法简单、快速、成本低，易于实现单壁碳纳米管的大规模分离该方法简单、快速、成本低，易于实现单壁碳纳米管的大规模分离.Ref.Large-scale single-chirality separation of single-wall carbon nanotubes by simple gel chromatography.Nature Communications.2011.5.1-8 技术来源于日本筑波技术来源于日本筑波 先进工业科学与技术国家研究所先进工业科学与技术国家研究所 （National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,Tsukuba,Japan.）实例实例3.3.反胶束萃取技术分离纯化漆酶反胶束萃取技术分离纯化漆酶What Is Reverse Micelles?What Is Reverse Micelles?反相乳液反相乳液生物来源，生物相容性，无毒无害What Is RL-based RME?What Is RL-based RME?Rhamnolipid-based Reverse Micelle Extraction SDS-PAGE AnalysisSDS-PAGE Analysis1-Crude Extract1232-After RME3-MarkerThe Reuse of Reversed The Reuse of Reversed MicellarMicellar System System该反胶束萃取体系还能反复利用，既减少环境污染，又节省成本。
该反胶束萃取体系还能反复利用，既减少环境污染，又节省成本AOT&Tween-80:synthetic surfactant反胶束萃取提取漆酶反胶束萃取提取漆酶优化条件优化条件1.鼠李糖酯基反相乳液萃取（鼠李糖酯基反相乳液萃取（RL-based RME）能成功用于萃取和纯化漆酶能成功用于萃取和纯化漆酶2.RL-based RME比合成型表面活性剂萃取效率更高比合成型表面活性剂萃取效率更高3.工艺条件对萃取效率产生重要影响工艺条件对萃取效率产生重要影响4.该体系最佳优化条件：该体系最佳优化条件：3.3 mM RL,50 mM KCl,pH 5.5,萃取萃取40分钟；分钟；反相萃取：反相萃取：250 mM KCl，pH 7.0，萃取时间：，萃取时间：40分钟分钟5.SDS-PAGE方法证明鼠李糖酯基反相乳液萃取得到较高的漆酶纯度和收率方法证明鼠李糖酯基反相乳液萃取得到较高的漆酶纯度和收率反胶束萃取的优点反胶束萃取的优点（1）在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子萃取后进入反胶团内部的）在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子萃取后进入反胶团内部的“水池水池”中，中，避免了与有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜内相似，故能很好保持其生物活避免了与有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜内相似，故能很好保持其生物活 性，解决了蛋白质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂的问题，为蛋白质的提取性，解决了蛋白质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂的问题，为蛋白质的提取 和分离开辟了一条新的途径。
和分离开辟了一条新的途径2）成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现连续操作）成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现连续操作（3）反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分离技术反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分离技术过滤过滤水浸提水浸提粉碎粉碎甜菊叶甜菊叶滤渣滤渣HZ-818吸附吸附FeCl3Ca(OH)2滤渣滤渣滤液滤液解吸液解吸液过滤过滤滤液滤液浸提工段浸提工段335脱色脱色732脱盐脱盐凝聚工段凝聚工段残液残液成品成品回收乙醇回收乙醇喷雾干燥喷雾干燥浓缩浓缩60%乙醇乙醇吸附精制工段吸附精制工段实例实例4.从甜菊叶中提取从甜菊叶中提取 甜菊糖苷的工艺流程图甜菊糖苷的工艺流程图（浓缩：减压旋蒸）（浓缩：减压旋蒸）。