核酸提取阅历及原理总结核酸提取阅历及原理总结 主办单位：螺旋网 主讲人：wsuquan 时 间：2021.4.21主要内容主要内容 一、核酸的发现一、核酸的发现、核酸的分类和功能、核酸的分类和功能、核酸的理化性质核酸的理化性质 二、细胞裂解二、细胞裂解 三、核酸提取三、核酸提取 四、核酸纯化四、核酸纯化 五、核酸检测五、核酸检测 六、核酸除杂质六、核酸除杂质 核酸的发现 核酸是1869年米 歇尔(F.Miescher)在脓液 的白细胞中发现的，他 当时称之为核素阿尔 特曼(R.Altmann)于1889年 认识其酸性后，定名为核 酸核酸分为核糖核酸 (RNA)和脱氧核糖核酸 (DNA)两大类脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸DNAlDNADNA分子含有生物物分子含有生物物种的一切遗传信息，种的一切遗传信息，分子量普通都很大分子量普通都很大除除RNARNA病毒外lDNADNA为双链分子，其为双链分子，其中大多数是链状构造中大多数是链状构造大分子，也有少部分大分子，也有少部分呈环状构造呈环状构造核糖核酸核糖核酸RNA RNA主要是担任DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多RNA为单链分子，根据RNA的功能，可以分为三种：信使核糖核酸mRNA；转运核糖核酸tRNA；核蛋白体核糖核酸rRNA。
核酸的理化性质核酸的理化性质 RNA的纯品都呈白色粉末或结晶，的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA那么为白色类似石棉样的纤维状物那么为白色类似石棉样的纤维状物DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，和核苷酸都是极性化合物，普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，水，RNA钠盐在水中溶解度可达钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶，呈黏性胶体溶液细胞裂解细胞裂解 裂解原理裂解原理 细胞的裂解方法细胞的裂解方法 裂解方法的评价裂解方法的评价 样品与裂解液的比例样品与裂解液的比例细胞裂解细胞裂解-裂解原理裂解原理 经典的裂解液几乎都含有去污剂 和盐盐的作用，除了提供一个适宜的裂解环境，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏、维持核酸构造的稳定 等去污剂那么是经过使蛋白量变性，破坏膜构造及解开与核酸相衔接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中裂解体系中还能够参与蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
细胞裂解细胞裂解-细胞的裂解方法细胞的裂解方法机械方法化学试剂法反复冻融法酶解法细胞裂解细胞裂解-裂解方法的评价裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法，可以以为是抽提基因组 DNA 的首选高浓度蛋白量变性剂(如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首选含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点细胞裂解细胞裂解-样品与裂解液的比例样品与裂解液的比例 裂解液的用量原那么是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记核酸提取核酸提取 提取是使样品中的核酸游离在裂解体系提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程中的过程DNA提取的几种方法 1 浓盐法 2 阴离子去污剂法 4 水抽提法 3 苯酚抽提法RNA提取 总RNA的试剂盒快速提取 蛋白酶热酚法 氯化锂法提取总RNA核酸纯化核酸纯化-方法方法 经典的运用苯酚/氯仿抽提的纯化技术 运用离子交换介质的纯化技术 密度梯度离心法 运用吸附介质的纯化技术核酸纯化核酸纯化-纯化方法评价纯化方法评价 针对不同的用途，选择不同的纯化方法，任何一种方法他都有其优缺陷，在实验中，没有错误的方法，只是选择的方法不正确。
核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀醇的沉淀 沉淀的原理目的 沉淀剂的选择 沉淀温度的选择核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀醇的沉淀-目的目的 目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质主要是盐的分别核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀醇的沉淀-沉淀剂沉淀剂 醇沉淀运用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这醇沉淀运用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现发现乙醇沉淀的核酸纯度更高异丙醇沉淀的核酸乙醇沉淀的核酸纯度更高异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上挪动，颜色比较的核酸比较蓬松，容易从壁上挪动，颜色比较白这是景象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸白这是景象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤因此，少量核酸不容易丢掉，但比较难洗涤因此，少量核酸用异丙醇沉淀用异丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀醇的沉淀-温度温度 假设核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原那么上不要运用低温沉淀低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大添加。
核酸纯化核酸纯化-核酸的洗涤核酸的洗涤洗涤目的方法首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时(使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四那么是去上清要彻底核酸纯化核酸纯化-核酸的溶解核酸的溶解 其中 RNA 以水为主，DNA 那么多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解核酸纯化核酸纯化-核酸保管核酸保管 核酸在保管中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比普通的我们选择，-20 或70 保管的稳定假设温度不适宜，保管中核酸发生降解或者消逝，首要缘由是酶残留导致的酶解，第二个缘由那么是保管核酸溶液的 pH 值不适宜导致的水解还有一个不为人注重的，就是 EP 管对核酸的影响核酸纯化核酸纯化-核酸的浓缩核酸的浓缩 运用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法在中等浓度单价阳离子存在下，参与一定量的乙醇后，所构成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中核酸质量的检测问题核酸质量的检测问题 关于紫外分光光度仪的检测关于紫外分光光度仪的检测 关于电泳检测关于电泳检测关于紫外分光光度仪的检测关于紫外分光光度仪的检测 在核酸分子中，由在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，具有共轭双键体系，因此具有独特的紫因此具有独特的紫外线吸收光谱，普外线吸收光谱，普通在通在260nm260nm左右有左右有最大吸收峰，可以最大吸收峰，可以作为核酸及其组份作为核酸及其组份定性和定量测定的定性和定量测定的根据。
根据关于电泳检测 察看琼脂凝胶中DNA的最简一方法是利用荧光染料溴化乙锭进展染色该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的亲密接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所添加核酸中杂质的去除核酸中杂质的去除 肝糖元、淀粉及粘多糖 蛋白质的除去 不同类型核酸的分别 同类核酸的分别核酸中除杂质核酸中除杂质-肝糖元、淀粉及粘多糖肝糖元、淀粉及粘多糖 取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少参与淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处置，使之构成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分别核酸中除杂质核酸中除杂质-蛋白质的除去蛋白质的除去 参与去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分别纯化各阶段均可反复运用此法去污剂与氯仿法或苯酚法结合运用，效果更加理想氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面构成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分别纯化中也常反复运用苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质那么沉淀于酚层，然后取水相参与乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，剩余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去核酸中除杂质核酸中除杂质-不同类型核酸的分不同类型核酸的分别别 在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法在DNA中加核糖核酸酸酶选择地破坏RNA，是除RNA比较有效的方法核酸中除杂质核酸中除杂质-同类核酸的分别同类核酸的分别 DNA混合物的分别：主要是变性或降解的DNA和天然的分别RNA混合物的分别经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物进一步纯化时，多运用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法螺旋网管理团队赞赏他参与！螺旋网管理团队赞赏他参与！。