单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,第15章 色谱分析方法导论,,,15.1 概述,,历史、色谱分离过程、分类,,15.2 色谱流出曲线,,色谱图及相关术语,,15.3 色谱法基本原理,,描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述(塔板理论及速率理论),,15.4 分离度及色谱分离方程,,分离度及色谱分离方程、影响分离的因素,1,,15.1 概述,,化学分析方法的基本要求是其选择性要高即，在分析过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！,,20,世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取,,现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域历史：,1903,年，俄国植物学家,Mikhail Tswett,最先发明他采用填充有固体,CaCO,3,细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物,(,叶绿素和叶黄素,chlorophylls & xanthophylls),加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分 离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱 (希腊语中,“chroma”=color; “graphein”=write,) 。
50,年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分析发展的要求1937-1972,年，,15,年中有,12,个,Nobel,奖是有关色谱研究的！,2,,色谱分离基本原理：,,使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面样品中各组份在两相中进行不同程度的作用与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的“带,(band),”或“区,(zone),”，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析色谱分类方法：,,1. 按固定相外形分：,,柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱2. 按组份在固定相上的分离机理分：,,吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；,,分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；,,离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；,,凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用3,,3. 按两相状态分,4,,15.2 色谱流出曲线（色谱图）,,,,,,,,,,,,,,,,,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,5,,色谱术语：,,1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，,S/N,大的、稳定的基线为水平直线。
2）峰高：色谱峰顶点与基线的距离3）保留值,(Retention value, R),,,a.,死时间,(Dead time, t,0,),：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近据,t,0,可求出流动相平均流速,6,,,b.,保留时间,t,r,：试样从进样到出现峰极大值时的时间它包括组份随流动相通过柱子的时间,t,0,和组份在固定相中滞留的时间c.,调整保留时间 ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间即,,,由于时间为色谱定性依据但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值d.,死体积,V,0,：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和勿略后两项可得到：,,,其中，,F,co,为柱出口的载气流速,（mL/min),，其值为：,,,,F,0,-检测器出口流速；,T,r,-室温；,T,c,-柱温；,p,0,-大气压；,p,w,-室温时水蒸汽压7,,e.,保留体积,V,r,：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。
f.,调整保留体积 ：某组份的保留体积扣除死体积后的体积g.,相对保留值,r,2,1,：组份,2,的调整保留值与组份,1,的调整保留值之比注意：,r,2,1,只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长,L,、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是,GC,中广泛用于定性的依据！,,具体做法：固定一个色谱峰为标准,s,，然后再求其它峰,i,对标准峰的相对保留值，此时以,,表示：,,, >1,,又称选择因子,(Selectivity factor),8,,h.,区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素通常有三种表示方法：,,标准偏差,,：,0.607,倍峰宽处的一半半峰宽,W,1/2,：峰高一半处的峰宽W,1/2,=2.354 ,,峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离W= 4,,,,色谱流出曲线的意义：,,色谱峰数=样品中单组份的最少个数；,,色谱保留值——定性依据；,,色谱峰高或面积——定量依据；,,色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；,,色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据9,,15.3 色谱法基本原理,,两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的,,,热力学,性质决定。
每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程,,,动力学,性质决定因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行一、描述分配过程的参数,,分配系数,(,Distribution constant, K)：,,,描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数K,只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关10,,2. 分配比,(Retention factor or capacity factor, k)：,,在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比它反映了组分在柱中的迁移速率又称保留因子其中,V,m,V,0,，V,s,为固定相体积分配比,k,的求算：,,1）组分滞留因子：,,,2）又，,,3）因此，,,11,,3.,K,与,k,的关系：,,,,,,称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数对填充柱，,=6~35,；对毛细管柱，,=60~6004.,,选择因子,,：色谱柱对,A、B,两组分的选择因子,,定义如下：,,,,A,为先流出的组分，,B,为后流出的组分。
注意：,K,或,k,反映的是某一组分在两相间的分配；而,,是反映两组分间的分离情况！当两组分,K,或,k,相同时，, =1,时，两组分不能分开；当两组分,K,或,k,相差越大时，,,越大，分离得越好也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件,和,k,是计算色谱柱分离效能的重要参数！,12,,二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述,,1. 塔板理论,（Plate theory),,1952,年，,Martin,等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布塔板理论假定：,,1）塔板之间不连续；,,2）塔板之间无分子扩散；,,3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论,,塔板高度,H,；,,4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；,,5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入当塔板数,n,较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数,n>50,时，峰形接近正态分布13,,,根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数,n,的公式，用以评价一根柱子的柱效。
由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：,,,,可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定若柱长为,L,，则每块理论塔板高度,H,为,,,,,由上述两式知道，理论塔板数,n,越多、理论塔板高度,H,越小、色谱峰越窄，则柱效越高但上述两式包含死时间,t,0,，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效通常以有效塔板数,n,eff,和有效塔板高度,H,eff,表示：,,14,,有关塔板理论的说明：,,1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；,,2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响因此它不能解释：,,峰形为什么会扩张？,,影响柱效的动力学因素是什么？,15,,2. 速率理论,（Rate theory）,,1956,年，荷兰化学工程师,van Deemter,提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高,H,概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了,van Deemter,方程：,,,,,u,为流动相线速度；,A，B，C,为常数，其中,,A,—分别表示涡流扩散系数；,,B,—分子扩散系数；,,C,—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。
该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低,H,，从而提高柱效16,,1）涡流扩散项,(Multipath term, A),,在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同——流出时间不同——峰形展宽展宽程度以,A,表示：,,A=2d,p,,其中,d,p,—填充物平均直径；,,—填充不规则因子可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小,A,，提高柱效对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即,A=0,流动方向,17,,2）分子扩散项,(Longitudinal diffusion term, B/u),,纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽其大小为,,B=2D,,,—称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；,,D,—组分在流动相中的扩散系数组份为气体或液体时，分别以,D,g,或,D,m,表示；,,讨论：,,分子量大的组分，,D,g,小，即,B,小,,,D,g,,随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；,,流动相分子量大，,D,g,小，即,B,小；,,,u,增加，组份停留时间短，纵向扩散小；,（,B/u）,,,对于液相色谱，因,D,m,,较小，,B,项可勿略。
球状颗粒；,,大分子量流动相；,,适当增加流速；,,短柱；,,低温18,,3）传质阻力项,(Mass-transfer term, Cu),,因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同下面分别作讨论a）气液色谱：传质阻力项,C,包括气相传质阻力系数,C,s,和液相传质阻力系数,C,l,流动相,固液界面,固定液,组分分子,C,l,C,g,讨论：,,减小填充颗粒直径,d,p,；,,,采用分子量小的流动相，使,D,g,增加；,,减小液膜厚度,d,f,，C,l,下降但此时,k,又减小因此，当保持固定液含量不变时，可通过,,增加固定液载体的比表面来降低,d,f,但比,,表面过大又会因吸附过强使峰拖尾增加柱温，可增加,D,l,，,但,k,值也减小，为保,,持合适,C,l,值，应控制柱温19,,b）液液色谱：传质阻力项,C,包括流动相传质阻力系数,C,m,和固定相传质阻力系数,C,s,讨论：,,流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力,C,m,、,滞留的流动相传,,质阻力,Cs,分别与填充物大小,d,p,、,扩散系数,(,D,m,),、,微孔大小及其数量等,,有关。
因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在,,固定相和流动相中的扩散系数,D,、,适当降低线速度、短柱固定相传质阻力与液膜厚度,d,f,、,保留因子,k,和扩散系数,D,s,等有关因此，降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中液相传质阻力的表述相同,sm,20,,4）流速,u,,由,van Deemter,方程,H = A + B/u + Cu,知道：,,当,u,一定时，仅在,A、B、C,较小时，,H,较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽以,u,对,H,作图，可得,H-u,曲线（如图），从该曲线得到：,,涡流扩散项,A,与流速,u,无关；,,,低流速区(,u,小)，,B/u,大，分子扩散项占主导，,,此时选择分子量大的气体如,N,2,和,Ar,为载气，可,,减小扩散，提高柱效；,,,高流速区(,u,大)，,Cu,大，传质阻力项占主导，,,此时选择分子量小的气体如,H,2,和,He,为载气，,,可增加扩散系数，提高柱效；,,,曲线的最低点对应最佳线速,u,opt,( ) 下的,,最小板高,H,min,( )；,,,LC,的,H,min,和,u,opt,均比,GC,的小一个数量级，即在,,,LC,中，较低流速可获得较大的柱效。
板高，H(cm),H,min,A+B/u+Cu,C,m,u,C,s,u,A,B/u,21,,5）固定相颗粒大小对板高的影响,,实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小即，在,HPLC,分析中采用细粒作固定相的理论根据！,,但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现,HPLC,的分析要求上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素，但是如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？,板高, H(cm),22,,15.4 分离度及色谱分离方程,,一、分离度,(Resolution, R),,同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标也称总分离效能指标或分辨率其定义为：,,,,,,,,利用此式，可直接从,色谱流出曲线上求出分离度,R,R,越大，相邻组分分离越好当,R=1.5,时，分离程度可达,99.7%,，因此,R=1.5,通常用作是否分开的判据23,,R=1.5,R=0.75,R=1.0,响应信号,保留时间,t, min,24,,二、色谱分离方程,,R,的定义并未反映影响分离度的各种因素也就是说，,R,未与影响其大小的因素：柱效,n,、选择因子,,和保留因子,k,联系起来。
对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数,K,相差小，可合理假设,k,1,k,2,=k，W,1, W,2,=W,因此可导出,R,与,n（n,eff,）、,和,k,的关系：,25,,附, 具体推导过程如下：,26,,有关色谱方程的讨论：,,1）分离度,R,与柱效的关系,,分离度,R,与理论塔板数,n,有关，即,R,受热力学性质的影响对具一定相对保留值,,的物质对，,R,与有效塔板数,n,eff,有关，说明,n,eff,可正确代表柱效能由色谱方程可得：,,因此可通过增加柱长提高分离度然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度,H,的方法比增加柱长更有效2）分离度,R,与保留因子,,的关系,,,越大，柱选择性越好，对分离有利,的微小变化可引起,R,较大改变如，当,,从,1.01,增加至,1.10,(增加,9%,)时，,R,则增加,9,倍(但,>1.5, R增加不大),改变,,的方法有：降低柱温、,改变流动相及固定相的性质和组成,3）分离度,R,分配比,k,的关系,,,k,增加，分离度,R,增加，但当,k>10,，则,R,的增加不明显通常,k,在,2~10,之间。
改变,k,的方法有：适当增加柱温,(GC),、,改变流动相性质和组成,(LC),以及固定相含量27,,70%CH,3,OH,,+30H,2,O,60%CH,3,OH,,+40H,2,O,50%CH,3,OH,,+50H,2,O,40%CH,3,OH,,+60H,2,O,溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响(梯度淋洗),1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌,,4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；,改变组成使,k,最佳,28,,色谱分离中的问题,,由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温,（GC）,和梯度淋洗,（LC）,来解决这个问题29,,三、分析时间,t,,分析时间通常指最后一个组分出峰的时间由以下三式：,,,,,得到,,,可见，分析时间与,R，，k、H/u,等参数有关R,增加,1,倍，分析时间则是原来的,4,倍实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析30,,概念、表示方法及计算公式汇总,表-1,31,,表-2,32,,例：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30 min。
物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min试问：,,1）柱分辨率R；,,2）柱平均理论塔板数n,av,,3）平均塔板高度H,av,,4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？,,5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？,,6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？,33,,1）,,,2）,,,,3）,,,4）,34,,5）,,,,,,6）,35,,。