微生物的显微直接计数法一、实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能二、实验原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨菌体较大的酵母菌或霉菌抱子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫•霍泽（PetrofHausser）细菌计数板两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成计数区边长为1mm,则计数区的面积为lmm2,每个小方格的面积为l/400mm2盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量已知：1mm3体积=10mmX10mmX10mm=1000mm3所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4X106个小方格，即系数K=4X106因此：每ml菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数（N）X系数（K）X菌液稀释倍数（d）三、实验器材1•活材料：酿酒酵母（Saccharomycescerevisia®斜面或培养液2•器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mmX22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸四、实验方法1•视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度2•取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片3•将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）4•静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度5•计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N）,按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存五、实验作业：将实验结果填入下表中计数次数每个大方格菌数稀释倍数试管斜面中的总菌数平均值12345第一次第二次稀释平板测数法一、实验目的了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
二、实验原理稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验三、实验器材1. 活材料：苏云金芽抱杆菌（BacillusthuringiensiS菌剂2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）3.器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等四、实验方法1•样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散，静置20-30S，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。
图22-1平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度2. 平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法1）混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中,再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50°C的细菌培养基（图22-2），轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养至长出菌落后即可计数2）涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。
再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲将涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数五、实验作业：将实验结果填入下表中稀释度10-710-810-9菌落数123平均123平均123平均1g样品活菌数计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算混合平板计数法：每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板计效法：每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X10X稀释倍数稀释培养测数法（MPN）一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法二、实验原理最大或然数（mostprobablenumber，MPN）计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数稀释度重复10-3数55出现生长的管数555如某一细菌在稀释法中的生长情况如下;10-410-510-610-710-85555410根据以上结果，在接种l0-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种l0-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17,然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100000）那么，1ml原菌液中的活菌数=17X100000=17X105即每毫升原菌液含活菌数为1700000个在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可稀释度重复10-110-2数444出现生长的管数443如某一微生物生理群稀释培养记录为:10-310-410-5442110-64以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30,则每毫升原菌液中含活菌30X102个按照重复次数的不同，最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长对土壤样品而言，分析每个生理群的微生物需5—7个连续稀释液分别接种，微生物类群不同，其起始稀释度不同（见附表1）；二是每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。
不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果若要求出土样中每克干土所含的活菌数,则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数（烘干后的土样质量/原始土样的质量）计算式为:菌数近视值、*数量指标第T立数的稀释度土样中干土所占的质量分数三、实验器材1. 土壤样品：肥沃菜园土2. 培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养液（附录三、15）22管（每管装5ml,加1cmX4.5cm滤纸l条）3. 器材：90ml无菌水（装入250ml三角瓶中，并装有15—20个玻璃珠）、9ml无菌水、lml刻度无菌吸管、试管架、记号笔四、实验方法1. 称取10克土样，放入90ml无菌水中，振荡20min,让菌充分分散，然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1—10-6的土壤稀释液2. 将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上，第一纵列的4支试管上标以10-2，第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6（即采用5个稀释度，4个重复），另外2支试管留作对照3. 用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中，再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中。
对照管不加稀释液4•将所有试管置28—30°C培养7天后观察结果5.精确称取3份10克稀释用土，放入称量瓶中，置105-110C烘2h后放入干燥器中，至恒重后称重，然后计算干土在土样中所占的质量份数五、实验作业：培养7天后，取出试管，检查实验结果凡有固氮菌生长的试管，则培养液与滤纸接触处有黑褐色或粘液状菌膜，即为阳性，否则为阴性对照管应为阴性依次检查每管生长情况，将结果填入下表，计算每克干土所含的活菌数土壤稀释度10-210-310-410-510-6重复次数44444固氮菌生长管数数量指标干土的质量分数菌数近视值每克干土固氮菌数个/克干土附表23-1几种主要微生物生理群MPN计数法一览表微生物生理群培养基常用稀释度常用重复次数培养时间（天）主要检查方法氨化细菌蛋白胨氨化培辛甘养基0-610-947根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨亚硝酸细菌铵盐培辛甘养基0-2—10-7314根据培养液加格利斯试剂I及II的反应，出现绛红色证明有N0-生成；或在培养中加锌碘淀粉试2剂及体积比值为20%的HSO,若出现蓝色，证明24有N0-生成3硝酸细菌亚硝酸盐培养基0-2—10-6314根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有N0-生成。
3反硝化细菌反硝化细菌培辛甘养基0-410-8314根据杜氏小管有尢气体，确定有尢N生成；利2用格利斯试剂I及II和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无N0-生成及有无NH存在，判断反硝化作用23进行情况好气性自生固氮菌阿须贝无氮培辛甘养基0-2—10-637-14根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性自生固氮菌生长好气性纤维素分解菌赫可逊噬纤维培养基0-1—10-5314根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有无好气性纤维素分解细菌的生长厌气性纤维素分解菌嫌气性纤维素分解细菌培养基0-1—10-5314-21根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤维素分解细菌的生长硫化细菌硫化细菌培养基0-2—10-8321-23在每管培养液中加入10g/L的BaCL溶液2滴，2如有白色沉淀出现，则证明有硫化菌活动反硫化细菌斯塔克反硫化细菌培辛甘养基0-2—10-7321-30根据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。