生物质发酵生产丁二酸项目调研•、项目可行性报告(一〕立项的背景和意义丁二酸〔Succinic Acid〕又称琥珀酸，是一种重要的“C4平台化合物〃，广泛存在于动 植物和微生物体内，是TCA循环的中间产物之一，它作为有机合成原材料、中间产物或专 用化学品可应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业等众多领域其 中医药领域，主要用于生产琥乙红霉素等药品；农业领域，主要用于生产植物生长调节剂、 杀菌剂等；食品领域，主要用于液体调味品与炼制品的风味改良剂等；染料领域，主要用于 生产高级有机颜料酞菁红等,2010年丁二酸在这四个领域总价值超过24亿美元除此之外， 丁二酸的主要潜在应用领域是根底化工原料，它可以作为许多重要的中间产物和专业化学制 品，还可以取代很多基于苯和石化中间产物的化学品，这可减少在超过300种苯基化学制品 的生产和消费过程中所产生的污染，丁二酸的结构是饱和的二羧酸，可以转化为包括1,4-丁 二醇(BDO)、四氢咲喃(THF)、Y-丁内酯(GBL)、己二酸和N-甲基吡咯烷酮等一系列重要的 工业化学品据统计丁二酸全世界市场需求量可高达2700万t/a，美国能源部发布的报 告中将丁二酸列为12种最有潜力的大宗生物基化学品的第一位。
图1.1是以丁二酸与其衍 生物为原料的化学制品路线图图1.1 丁二酸与其衍生物路线简图采用生物法制备丁二酸的技术将填补了国内生物法路线生产丁二酸的空缺丁二酸通过 加氢复原反响可以制取1,4 丁二醇，丁二酸分别与1,4-丁二醇和己二醇进展聚合即可得到生 物可降解塑料PBS〔聚丁二酸丁二醇酯〕和PHS〔聚丁二酸己二醇酯〕假设过程中使用的 氢气和热量也是使用生物质分解和发酵产生的话，那整个聚酯多元醇领域的原料和能量就应 该可以算是与传统能源完全别离了，该项目将成为生物质循环利用的示X性工程另外，由于石油危机与环境污染的双重压力，生物质发酵法生产丁二酸以其具有节约大 量的石油资源并且可以降低由石化方法产生的污染等优点而备受国内外专家学者的重点关 注因此，本技术属于国家鼓励和支持的废弃资源综合利用和节能减排项目，是循环经济和 低碳经济开展模式项目，并在2011年获得总统绿色化学挑战奖，也是国家“86〞3 计划和重 点鼓励开展类项目，符合国家与局部省市相关产业政策导向与传统化学方法相比，微生物发酵法生产丁二酸具有诸多优势：生产本钱具有竞争力， 因此对于聚氨酯行业的开展具有强有力的支撑作用，有助于我国聚氨酯产业开展；利用可再 生的农业资源包括二氧化碳作为原料，防止了对石化原料的依赖，实现了使用可再生资源替 代不可再生资源进展中间体的制作；减少了化学合成工艺对环境的污染。
专家分析认为，未来几年我国聚酯二元醇的年需求量将达到300 万吨以上，在面对不可 再生能源的紧缺条件下，石化法生产丁二酸的产量将会受到限制，加上 PBS 产业化技术的 完善和国内外对生物可降解塑料需求的不断拓展以与丁二酸新应用领域的不断开发，因而这 将给生物质发酵制取丁二酸的应用留下了非常大的开展空间和十分广阔的市场前景 〔二〕国内外丁二酸研究现状和开展趋势 〔1〕国内外丁二酸市场概述丁二酸是用于化工、制药、食品和农业等领域的一种重要根底原料和中间体一方面由 于石油价格剧烈波动，石化法生产丁二酸的本钱一直居高不下，另外发酵法能够使温室气体 排放量减少 50%，因而发酵法代替石化法生产丁二酸的工艺正在逐渐兴起另一方面目前 绿色化学品的市场需求也在不断增长，自然也会牵动对生物基丁二酸的需求2011年全球丁二酸的产能约4 万吨，其中 97%的丁二酸来源于石油基原料，而生物基 丁二酸仅占 3%，从应用领域来看，丁二酸主要用于树脂、涂料和油漆等领域约占 19.3%， 其他重要领域包括医药〔15.1%〕、食品〔12.6%〕、PBS /PBST〔9%〕和聚酯多元醇62%〕 从丁二酸市场分布来看， 2011 年，欧洲占市场总量的 33.6%，亚太地区占 29.6%，北美占 29.2%。
亚太地区预计将是未来增长最快的市场，如中国、印度和日本，其中，中国处于主导地位〔图 2.1〕图 2.1 2011 年全球丁二酸市场分布据Transparency预测，全球丁二酸市场将从2011年的2.403亿美元增长到2018年的8.326 亿美元， 2012~2018年的年均增长率达19.4%， 2018年产量将超过25万吨， 1,4-丁二醇、增塑 剂、聚氨酯和树脂需求的增加以与涂料、染料和墨水一直是该产品市场的主要驱动因素，然 而昂贵的原材料和日益严重的环境问题成为了制约该市场增长的主要因素1.1 国内丁二酸市场丁二酸在中国的生产始于上世纪60 年代末期，生产开展较快，到2013 年丁二酸的产量 占世界总产量的 40%，目前国内丁二酸的总产能约12.5 万吨/年，年产量在6 万吨左右随 着以丁二酸为原料的PBS等新型生物可降解塑料的逐步产业化，丁二酸的开展将迎来新契 机据专家预测，2020年国内可降解生物塑料市场需求量为300万吨，以生产1吨PBS需0.6 吨丁二酸计算，未来国内丁二酸的年需求量将达到180 万吨左右，保守估计到2020年，我国 生物法丁二酸产能将达到10万吨/年，加上下游市场的不断开发，需求量也将保持10%以上 的年增长率，市场缺口巨大。
与此同时，国内已有多家企业正在积极筹备上马PBS项目，而某某和兴公司如此领先 一步，率先与清华大学达成合作意向，在目前3000 吨/年规模的根底上，计划在3 年内建设 一条10万吨/年PBS生产线，同时上马的还有与之配套的6万吨/年丁二酸项目但一直以不 可再生的战略资源石油产品作为原料的传统丁二酸生产方法导致了高价格和高污染，抑制了 丁二酸作为一种优秀的化学平台产品的开展潜力，而采用微生物发酵法生产正好可以弥补1.2 国外丁二酸市场国外丁二酸市场看好，原因是丁二酸的结构是饱和二羧酸，可以转化为1,4-丁二醇、四 氢咲喃、Y-丁内酯等其它四碳的化学制品，它的下游衍生物是很多行业的重要原料，在世 界X围内这些衍生物的市场潜力每年超过3 X 106吨为了使生物法生产丁二酸能够有效降低 本钱，美国能源部的4个实验室投资700 万美元，共同研究发酵法生产丁二酸通过生物发 酵法筛选一株优良的菌种，选择利用廉价的原料，经过合理的过程优化，生产出更具优势的 丁二酸产品，具有巨大的开展潜力，另外发酵法生产丁二酸也为农业碳水化合物产品打开一 个重要的市场由此可见，发酵法制备丁二酸的研究将成为21 世纪化学工业的一个重要方 向，它将使丁二酸与其衍生物市场X围更加宽广。
丁二酸的主要应用领域大致可分为5大市场：最大的市场为外表活性剂、清洁剂、添加 剂和起泡剂：第二个市场为离子鳌合剂，如电镀行业中的溶蚀和点蚀等；第三个市场是在食 品行业中作为酸化剂、PH改良剂和抗菌剂；第四个市场是与健康有关的产品，包括医药、 抗生素、氨基酸和维生素的生产：第五个市场也是最具开展前景的市场，即作为生物可降解 塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的主要原料不同市场对于丁二酸的纯度要求也是不同的，这 对于生物法制备丁二酸是十分有利的，因为化学法生产的丁二酸由于含有微量的其他不明化 合物，限制了其在食品、医药等行业的应用，而生物发酵法生产的丁二酸完全满足美国 FDA 的要求，并且已经给出了安全的许可〔2〕国内外生物基丁二酸生产企业概述2.1 国外主要企业经过多年的研发，生物基丁二酸在技术上获得突破，早期存在的生产本钱较高、性能不 高导致应用X围有限等不足已有明显改善，再加上其所具有的环保优势，这类产品的市场竞 争力越来越强目前，帝斯曼、巴斯夫、Myriant〔麦里安科技公司〕和BioAmber〔生物琥 珀公司〕均已兴建多个世界级规模的生物基丁二酸生产厂〔表2.1〕2.1.1 生物琥珀公司生物琥珀公司是一家从事生物材料加工的公司，于2010年1月22日建成了世界上第一套 商业化规模生物基丁二酸装置，采用由小麦衍生的葡萄糖为原料，初期生产能力为2000吨/ 年。
近年来，生物琥珀公司与日本三井公司〔Mitsui〕合作较为严密2013年生物琥珀公司 与日本三井公司合作在加拿大安大概省萨尼亚市启动一套大型生物基丁二酸生产装置，初始 产能为1.7 万吨/年，并可继续扩能到3.4 万吨/年 2014年生物琥珀公司和日本三井公司还 计划再共同建立两套装置，预计总产能将达到16.5 万吨/年第二个工厂先在泰国建立，再 在北美或是巴西建立第三个工厂，两套装置规模相当通过合作，生物琥珀公司和日本三井 公司将充分发挥各自的优势首先，生物琥珀公司已经研发出一个拥有专利的技术平台，将 工业生物技术和专利催化剂结合把可再生原料转化成化学品，从而能降低对石油的依赖，减 少本钱，其次，生物琥珀公司在法国的工厂能生产并销售丁二酸，已被证明有价格优势而 日本三井公司作为世界上最大的综合贸易公司之一，在国际化学品市场拥有很高的份额，有 利于生物琥珀公司生产的生物基丁二酸进展全球市场销售表2.1 国外主要企业的生物基丁二酸的产能比拟公司年产量/吨工厂地址运行时间巴斯夫/Purac合资公司50000--巴斯夫/Purac合资公司25000巴塞罗那2013 年BloAmber-ARD3000POMACLE〔法国〕2012 年BloAmber/Mitsul 合资公司65000TBA〔美国或巴西〕-BloAmber/Mitsul 合资公司17000〔前期〕34000〔后期〕萨尼亚市〔加拿大〕2013 年Myriant77110普罗维登斯湖〔美国路易斯安那州〕2014 年Myriant-中国蓝星110000某某〔中国〕-Myrlant-Uhde〔 owner and operator〕500〔第一年〕Infraleuna site〔德 国〕2012 年Reverdia〔 DSM-Roquette〕10000萨诺斯皮诺拉〔意大利〕2012 年注：来源ISIC公司报告2.1.2 麦里安科技公司美国麦里安科技公司2011年初在路易斯安那州开工建设全球最大的生物基丁二酸工厂， 并于2013年第一季度启动其在路易斯安那州普罗维登斯湖产能为1.36 万吨/年的生产装置， 计划在2014年初将产能扩大到7.7万吨/年。
2012年，麦里安科技公司与德国洛伊纳〔Leuna〕 的蒂森克虏伯伍德公司〔ThyssenKrupp Uhde〕合作开始商业化生产生物基丁二酸，生产工 艺可达商业化生产规模和产品质量的标准早在2009年，麦里安科技公司和蒂森克虏伯伍德 公司就商业化开发生物基丁二酸签订了独家联盟协议，旨在确保生物基丁二酸生产工艺具有 本钱竞争优势和生产高纯度产品；目前，麦里安科技公司正在研究与中国蓝星〔集团〕总公 司在某某建设生物基丁二酸项目，此外还与泰国PTT国际化学公司合作，在东南亚建设丁二 酸项目在销售方面， 2011年美国麦里安科技公司和日本双日株式会社就缔结销售和市场合 作关系，在日本、韩国、中国大陆和中国某某经销生物基丁二酸，目的是凭借双日株式会社 的市场覆盖，极大地提升麦里安科技公司生产的生物基丁二酸在这些地区的长期价值2.1.3 Reverdia〔DSM-Roquette〕由荷兰皇家帝斯曼集团〔Royal DSM〕和法国罗盖特公司〔Roquette Freres〕合资建成 的Reverdia公司，早在2010年初，就在法国Lestrem建成示X工厂，将这种生产技术投入实际 运用，并不断进展改良和优化，为产品大规模推向市场作好准备。
Reverdia公司于2012年10 月开始投产于意大利卡萨诺斯皮诺拉〔Cassano Spinola〕的第一个商业化的生物基丁二酸项 目,初始设计产能为1万吨/年，这也为全球丁二酸项目的大规模启动打下坚实根底oReverdia 公司还是目前唯一一家利用低PH值酵母技术进展大规模商业化生产的公司，该技术的获取 源于其公司的示X工厂，被Reverdia公司视作未来进一步提升产品性能的关键要素通过其 掌握的专利生产技术，Reverdia公司有望能够满足全球市场对于丁二酸日益增长的需求，从 而确立其在生物基丁二酸生产领域的领导地位帝斯曼与罗盖特强强联手，结合各自在材料 科学与生物技术与植物原料加工方面的优势，构成Reverdia公司开展的强劲推动力2.1.4 Succinity GmbH〔 BASF-Purac〕巴斯夫与CSM旗下普拉克〔Purac〕成立了合资公司Succinity GmbH，总部位于德国杜 塞尔多夫2013年在西班牙巴塞罗那建立的发酵能力为2.5万吨/年的生物基丁二酸装置正式 投产巴斯夫和CSM在2009年已签署共同开展协议并开始对丁二酸进展调研双方在发酵 和下游处理方面的互补优势形成了可持续的高效生产过程。
生产中使用的细菌为产丁二酸厌 氧螺菌，通过自然过程生产丁二酸这个过程可以生成很多可再生的原材料，结合了高效和 可再生原材料使用的优点，同时还具有较好的固碳效果另外巴斯夫和CSM还改建了普拉 克巴塞罗那附近的一家工厂，用来生产丁二酸，年产能约1 万吨，该工厂在2013年底正式投 产，并计划筹建第二个世界级规模的丁二酸工厂，产能达5万吨/年，以满足日益增长的丁二 酸使用需求2.2 国内主要企业国内以微生物发酵为根底的丁二酸绿色生产工艺才刚刚起步，同时由于PBT、PBS树脂、 医药与聚氨酯等行业近年来在国内开展较迅速，因而我国每年都要进口大量丁二酸与其下游 产品来满足生产需求我国现有丁二酸生产企业十余家，且大局部均以石化为原料〔表2.2〕 但我国对生物发酵法制备丁二酸的研究从未连续过， 2013年1月28日，扬子石化公司1000吨/ 年生物发酵法制丁二酸中试装置建成中交，该装置依托扬子石化现有装置与公用工程配套设 施，采用某某与高校科研单位共同开发的生物发酵法合成丁二酸技术，装置设计生产能力为 1000吨/年，年工作日300天，年生产时数7200小时生物法制取丁二酸项目主要利用可再生 生物质资源作为原料，采用丰富的农林生物质资源，确保了生物基丁二酸不受石油价格波动word的影响。
同时减少石油和煤等不可再生资源的消耗，达到节能减排的效果，为我国循环经济的开展和绿色GDP增长做出突出贡献表2.2 国内丁二酸生产单位与生产方法生产单位生产方法产能/吨某某远成化学合成法1500〜1800某某三信电化学法3000某某申人电化学法600某某宝玉化学合成法1000某某某某惠丰化学合成法300某某市利兴化学合成法10000某某长岭化学合成法3000某某金诺化学合成法500某某市琥珀酸项目发酵法前期3万后期10万扬子石化发酵法1000某某振兴电化学法1000某某仙桥电化学法1000某某云溪化学合成法50000某某飞扬电化学法10000〔3〕国内外丁二酸生产技术现状基于丁二酸在工业中的广泛使用，对应丁二酸的需求量在逐年递增，世界各国对其生产 方法研究在不断深入丁二酸的工业制法较多，目前主要有化学合成法，电化学法和新兴的 生物质发酵法，其中发酵法生产丁二酸主要是利用可再生能源和二氧化碳作为原料，开辟了 温室气体二氧化碳利用的新途径，且本钱低廉，环境友好，因此生物法生产丁二酸代表着未 来开展的方向化学合成法丁二酸的化学合成法主要有石蜡氧化法、乙炔法、催化加氢法、丙烯酸羰基合成法等 石蜡氧化法：传统的生产方法，石蜡在钙、锰催化下深度氧化得到混合二元酸氧化石蜡， 后者通过热水蒸汽蒸馏，去除不稳定羟基油溶性酸和酯后，水相中含有丁二酸，枯燥后得到 丁二酸的结晶〔图3.1〕。
该工艺比拟成熟，但收率和纯度都不高，且有污染催化加氢法：以顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐为原料，采用载有活性炭的镍或贵金属为催化剂，在大约130〜140°C, 2〜30x105 Pa条件下催化加氢得到顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐的催化加氢体系可分为多相和均相，其中多相催化体系又可分为气相催化加氢体系和液相催化 加氢体系催化加氢法是目前世界上使用最广泛的丁二酸工业合成方法，其转化率高，产率 高，产品纯度良好，无明显副反响，但操作要求较高，工艺复杂，本钱高，且污染严重丙烯酸羰基合成法：丙烯酸和一氧化碳在催化剂作用下，生成丁二酸，目前仍未工业化/低沸物石蜡催化剂 水蒸气蒸懈蒸发、结晶 氧化石蜡 * 丁二强憎分 J _酸 107-114V 分离、提纯、渔残液图3.1 丁二酸石蜡氧化法制备路线简图3.2电化学法以顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐为原料，电解复原得到丁二酸〔图3.2〕电解槽主要分 为隔膜和无隔膜两种，工作电极有铅、铅合金、石墨、不锈钢、铜、钛、二氧化钛电极等 电化学复原顺丁烯二酸合成丁二酸主要有两种方式：直接电复原和间接电复原直接电复原 是直接在电极外表由电子进攻双键或活性氢复原生成丁二酸间接阴极电复原主要以Ti3+ /Ti4+为媒质，间接复原顺丁烯二酸合成丁二酸。
丁二酸的电化学法虽然具有设备简单，产 品纯度高，无污染等特点，但实际生产发现还有许多问题需要解决，如电耗大、离子膜易破损、阳极消耗严重、工艺操作条件不佳等COOI1or || •卜 21F + 2c阳极反应:出 一*■ 2W : 1/20. + 2e总反应:^COOH^COOJI图3.2 丁二酸电化学法制备原理简图3.3发酵法生物发酵法是以淀粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、牛乳或其他微生物能够利用的废料为原 料，利用细菌或其他微生物发酵的方法生产丁二酸与其衍生物〔图3.3〕丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物一般情况下，丙酸盐生 产菌、典型的胃肠细菌以与瘤胃细菌均能够分泌丁二酸据报道，一些乳酸菌(Lactobacillus) 也能在特定的培养基上不同程度地产生丁二酸国外在20世纪90年代就开始发酵生产丁二酸 的研究，其中认为可接近工业化的发酵水平为产丁二酸浓度60 g・L-1以上，糖酸转化率0.8 g・g-1和生产效率1.5 g・(L・h)-1以上目前有望成为丁二酸发酵工业生产的微生物菌株主要有： 放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)工程 菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)、曼氏杆菌(Mannhei miasucciniciproducens) 以与重组大肠杆菌(Escherichia coli)等〔表3.1〕和可再生原料如：乳清、糖类、小麦、菊芋 粉与木质纤维素等。
由于天然菌株产丁二酸的能力非常低，发酵产物多种多样，对糖或丁二酸的耐受性比拟差，因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进展改良重组原料co2•预处理菌种•发酵一发酵液一＞ 提取一」「二酸图3.3 丁二酸生物法制备路线简图3.3.1乳清原料发酵生产丁二酸乳清是奶酪生产过程的副产物，每10 L牛奶可以得到1 kg奶酪和9 L乳清乳清中含有 3%〜8%的乳糖，0.8%〜1%的牛乳蛋白，1%的盐和0.1%〜0.8%的乳酸乳清可以液体、干乳 清和乳清渗透物的形式作为发酵原料〜48.7 g/Lo A. succiniciproducens在高CO2浓度的环境下培养，发酵液中丁二酸浓度最终 达34.7g/L，其中丁二酸与乙酸的比为4:1,乳糖的消耗率在90%以上，丁二酸对乳糖的产率 大于80%，证实了由乳清原料生产丁二酸的可行性表3.1国内发酵法制备丁二酸的主要研究进展研究机构研究进展江南大学开展菌株选育和工艺研究，获得比拟优良的产丁二酸放线杆菌菌株 〔Actinobacillus succinogenes CGMCC1593〕，利用制糖工业的副产物 糖蜜为碳源，初始总糖浓度为65g/L时，产丁二酸放线杆菌厌氧发酵 48 h, 丁二酸浓度可达，生产率〔L h〕某某大学底物52g/L葡萄糖发酵生产丁二酸达到，转化率达到50.7%某某工业大学木质纤维素水解液为碳源时分批培养的丁二酸最后浓度与得率分别为 和56%，生产率为〔L・h〕；连续培养的丁二酸得率为55%，生产能 力为〔L・h〕某某工业大学米用稀酸水解玉米籽皮制备混合糖液，脱毒脱色后，产丁二酸放线杆 菌NJ113培养基总糖浓度为50g/L时，丁二酸分批发酵的质量收率可 达，浓度可达，生产强度达〔L・h〕，总糖浓度为时，丁二酸质量收率 仍可达，浓度为，生产强度为〔L・h〕某某大学进展好氧发酵研究，对丁二酸产生菌S-1进展紫外线和亚硝基胍的复 合诱变后，筛选出丁二酸产量高、遗传性状稳定的菌株S-57，并对其 进展激光诱变，筛选出菌株SH-24, 丁二酸产量达到。
经鉴定该菌为 总状枝毛霉Mucor racemosus Fresenius〕SH-24韩国 Lee 等报道了 A. succiniciproducens ATCC29305和 M. succiniciproducens MBEL55E 分 批、连续发酵乳清生产丁二酸的情况在根底盐与乳清组成的培养基上,A. succiniciproducens ATCC29305菌体不生长，但在补加酵母膏和聚蛋白胨的乳清培养基中，菌体生长与产酸当葡萄糖和乳清作为混合底物时〔20g/L乳清和7g/L葡萄糖〕丁二酸产率和生产强度分别 为95%和0.46 g /〔L・h〕丁二酸浓度达15.5 g/L，比单以乳清为底物时的生产强度高出近一 倍在最优的稀释速率下连续发酵，丁二酸的生产强度达到1.35 g/〔L. h〕并且发酵液中， 丁二酸与乙酸比值提高到5.1:1~-1 连续厌氧发酵时，丁二酸产率63%~69%，生产强度达到3.9 g/〔L. h〕比分批培养提高了3.3倍结果明确了用廉价的乳清和玉米浆为原料可以有效的 生产丁二酸最近Wan等研究用Actinobacillussuccinogenes 130z发酵奶酪乳清也能生产丁二 酸。
50 g/L奶酪乳清的培养基，丁二酸的产率57 %,生产强度0.44 g/〔L・h〕乙酸和甲酸为 主要副产物3.3.2 糖类原料发酵生产丁二酸 含有由葡萄糖和果糖组成的二糖植物通常称为糖料植物，甜菜和甘蔗是蔗糖和糖蜜的主 要来源，甜高粱也可作为蔗糖的来源糖蜜是制糖工业的副产品，糖蜜一般含有大约40%~50%〔质量分数〕总糖〔主要成分 是蔗糖、葡萄糖和果糖〕，是发酵工业中较廉价的碳源原料糖蜜除了比葡萄糖价格低廉外， 还含有多种微生物生长所需要的营养素如维生素，氨基酸和矿物质等，是一种理想的发酵生 产丁二酸的原料印度Agarwal等报道从牛瘤胃中别离获得的产琥珀酸E. Coli，在优化后的 含甘蔗糖蜜和玉米浆的培养基中，其丁二酸的产量比用葡萄糖和蛋白胨培养基的产酸提高了 9倍在10L发酵罐中，初始甘蔗糖蜜总糖浓度50g/L, 36 h生成17 g/L丁二酸，丁二酸的产 率和生产强度分别为34%和0.5 g/(L・h)X宇鹏等研究用A. succinogenesCGMCC1593发酵甘 蔗糖蜜生产丁二酸，工业废糖蜜经酸预处理后作为培养基的碳源，培养液中总糖浓度为64.4 g /L，其中含44.9 g /L蔗糖，9.8 g /L葡萄糖，7.2 g /L果糖，分批发酵48 h产丁二酸46.4 g/L， 丁二酸产率79.5%。
在5 L发酵罐中进展补料分批发酵，丁二酸浓度可达到55.2 g/L董晋军 等研究了用甘蔗糖蜜原料半连续发酵生产丁二酸工艺，采用两级双流式半连续发酵操作， 39 个批次(一级罐连续时间269 h)，二级发酵罐平均产酸43.5 g/L,平均生产强度达到2.07 g /(L・h),较一样有效装液量的分批发酵或补料分批发酵单位时间产发酵液体积提高2~3倍甜 高粱是一种新型绿色可再生高能作物，平均含糖量7%~15%，其茎秆中富含50%~70%糖汁， 茎汁中的糖分以蔗糖为主〔最高占79%〕，其次是葡萄糖和果糖，茎汁中还含有N、Mg、Ca 元素因此也可以作为发酵的碳源表3.2 5 L发酵罐中甜高粱榨汁糖浆补料分批发酵生产丁二酸情况较好的结果〔表3.2〕榨汁液发酵培养基中以玉米浆为氮源，初始复原糖浓度60.5 g/L,在5 L发酵罐中，A. succinogenes CGMCC 1593分批发酵48h，产丁二酸47.2 g/L补料分批发酵 时，通过补加甜高粱榨汁糖浓缩液，控制发酵液中的糖浓度祂0〜30 g/L发酵48 h,总投入 甜高粱榨汁糖浆糖浓度为80.4 g/L〔按最终体积计〕，发酵剩余复原糖浓度为7.5 g/L,产丁二 酸浓度59.8 g/L,较分批发酵提高了 21%，生产强度1.25 g/(L・h)。
试验结果明确有良好应用 前景3.3.3 小麦水解发酵生产丁二酸谷类植物是淀粉的主要来源，杜晨宇等进展了以小麦为原料发酵丁二酸的研究整个过 程分两个阶段，第一阶段运用真菌将小麦淀粉转化为发酵原料，第二阶段用A. succinogenea ATCC55618发酵产丁二酸一种方法是将泡盛曲霉Aspergillus awamori 2B.163在含8%小麦粉的培养基中液体发酵96 h,发酵滤液〔含30 g/L的葡萄糖和100 mg/L的氨基氮〕用于A. succinogenea发酵，产丁二 酸5 g/L,副产物乳酸2.9 g/L, 丁二酸对小麦粉产率为0.063 g/g另一种方法，用富含葡萄糖 淀粉酶的Asp. awamori发酵滤液，水解面粉产生葡萄糖富集液，将Asp.awamori发酵滤渣中 的菌丝体自溶，制成氨基氮富集液，两者混合成含葡萄糖45 g/L，氨基氮500 mg/L的培养基， 经A. succinogenea发酵可产生16 g/L 丁二酸，副产物8 g/L乙酸和6 g/L甲酸，丁二酸对小麦粉 的产率为0.19g/g另外在第一阶段中，改用双菌固体发酵产酶，将泡盛曲霉Asp. awamori和 米曲霉Asp. oryzae分别在小麦麸皮培养基中固体发酵产淀粉酶和蛋白酶，然后分别用提取的 酶液水解小麦粉和面筋蛋白，制备含葡萄糖浓度140 g/L以上的糖富集液，与含3.5 g/L以上游 离氨基氮的富集液。
两种富集液混合作为A. succinogenea ATCC5561泼酵的原料，发酵过程 添加MgCO3，丁二酸浓度达到64 g/L说明小麦可作为发酵丁二酸的一种有效原料3.3.4 菊芋粉发酵生产丁二酸 菊芋是多年生块茎植物，菊芋块根成分中除水分外，含有大量菊糖，可达干重的70%〜80%，菊糖是以b-1, 2键连接的末端有一个蔗糖基的多聚果糖，使聚合度为32~34的多 糖菊糖水解后得到果糖和葡萄糖，不需提纯可直接用于发酵因此，也是发酵工业上一种 较廉价的碳源江南大学X璞课题组研究了菊芋为原料A.succinogenesCGMCC1593发酵生产丁二酸黑 曲霉Asp. niger SL-09发酵产菊粉酶，酶活达到46 U/mL发酵液该发酵液在50°C条件下按10% 加量与菊芋粉作用，水解得到菊芋糖浆A. succinogenes CGMCC 1593在含复原糖浓度为53.5 g化的菊芋糖浆发酵培养基中发酵36 h，产丁二酸43.5 g/L，生产强度1.22 g/〔L・h〕另一方 面初步研究了菊芋同步糖化发酵工艺菊芋粉为培养基碳源，玉米浆为氮源，按每克底物参 加40U菊粉酶的比例参力HAsp. niger SL-09培养液，60C保温10 min后，降温到37 C,接入 A. succinogenes SF-9进展同步糖化发酵，发酵72 h。
产丁二酸59 g/L，在此根底上采用补料 发酵，发酵过程总投入约菊芋粉192 g/L〔总计复原糖134 g/L〕，发酵96 h，丁二酸浓度98 g/L， 明确同步糖化发酵菊芋原料生产丁二酸有较好的应用价值3.3.5 木质纤维素原料生产丁二酸木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，用于工业发酵原料的木质纤维素主要有农业 废弃物如秸秆、木材和木质生物质等木质纤维主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤 维素是由b-1, 4-糖苷键连接而成的多糖，半纤维素是由带支链的多聚糖〔主要是已聚糖和 戊聚糖〕组成的杂多糖，而木质素是一种酚醛聚合物三者组成的木质纤维素具有很强的抗 水解和酶解特性，因此木质纤维素作为发酵原料必须经过预处理才能使用美国芝加哥大学的Donnelly2004年申请了E.coli基因工程菌〔ptsG、pflB、ldhA突变株 AFP184, AFP400，AFP404〕发酵工业级水解液〔ArkenoFs hydrolysate，玉米水解糖浆和纤 维素水解糖浆〕生产丁二酸的专利采用两段式发酵，前期耗氧〔6h〕，后期流加含有木糖 的工业级水解糖浆并通CO2厌氧发酵，192 h积累丁二酸63 g/L, 丁二酸对底物的产率在 0.6:1〜1.3:1。
有报道该技术已于2002年在Applied CarboChemials Inc.〔ACC〕公司进展了中 试规模试验韩国Lee PC等报道了木材水解液发酵产丁二酸采用2mmx4 mm大小的橡木块，于 215 °C汽爆预处理，再用纤维素酶，按每克底物20IU的用量，在50 °C下水解3d,得到含葡 萄糖和木糖分别为20 g/L和7 g/L的木材水解液A.succiniciproducens在木材水解液发酵培养 基中〔含复原糖糖27 g/L,玉米浆10 g/L〕分批发酵，积累丁二酸23.8 g/L,对糖产率和生产 强度分别为88%和0.74 g/(L・ h)Kim DY等研究了M.succiniciproducens MBEL55E发酵木材水 解液生产丁二酸，在橡木材水解液发酵培养基灭菌前，用NaOH预处理以减少灭菌过程所产 生的抑制物质，NaOH处理后的木材水解液含葡萄糖16 g/L,木糖7 g/L, M.succiniciproducens MBEL55E发酵12 h,积累丁二酸11.7 g/L, 丁二酸产率56%，生产强度从未预处理时的0.60 g/(L・h)提高到1.17 g/(L・h)，在稀释速率0.4 h-1的条件下连续发酵，丁二酸的产率55%，生产 强度提高到3.19 g/(L・h)。
瑞典H odge等研究了软木材稀酸水解液脱毒与脱毒水解液用于基因 工程菌E. coli AFP184生产丁二酸的发酵稀酸水解木质纤维素的过程中，会产生对微生物 生长与发酵有害的酚醛类等物质采用云杉木碎片，先在^值2、170 C的条件下稀硫酸水 解7 min,以水解其中的半纤维素，余下固体局部再在pH值2、200 C的条件下稀硫酸水解10 min,合并两步酸水解液，浓缩后用5%活性炭吸附脱毒E. coli AFP184在脱毒水解液发酵培 养基中，菌体生长与产酸加快；而在未经脱毒处理的水解液发酵培养基中，菌体不能生长与 产酸将脱毒处理的水解液用于E. coli的丁二酸发酵，先好氧培养11 h,再厌氧发酵42 h, 可积累丁二酸42.2 g/L, 丁二酸产率72%国内姜岷等报道了用玉米皮水解液为原料发酵产丁二酸粒径为20〜40目的玉米皮在料 液比18%, l10 C, l%硫酸条件下水解90 min,总糖浓度达85 g/L,总糖收率90%酸水解液word用活性炭脱色，脱色率达92%，脱色的总糖损失率低于5%,糠醛含量仅为0.236 g/L脱色 后的糖液用于A. succinogenes NJ113发酵产丁二酸，初始糖浓度为50 g/L时，丁二酸浓度达 35.8 g/L, 丁二酸产率为71.6%，验证了玉米皮水解液可替代葡萄糖作为丁二酸发酵的碳源。
陈可泉等用酸水解玉米纤维，采用CaCO3中和与活性炭脱色处理酸水解液，有效去除了水解 液中抑制发酵的物质，得到的水解糖液用于A. succinogenes NJ113发酵产丁二酸，在7.5L发 酵罐上，产丁二酸浓度达35.4 g/L, 丁二酸产率72.5%李兴江等报道了水解玉米秸秆发酵生产丁二酸采用碱解和酶解法处理， 40目的玉米秸 秆按1:5的比例在PH值12的碱性水溶液中，95 °C搅拌60 min,然后用50 Hz超声处理30 min， 硫酸中和PH值至中性，别离硫酸钙沉淀清液中参加纤维素酶和半纤维素酶，60 C搅拌酶 解180 min200 g秸秆粉水解得到52 g葡萄糖和24 g木糖通过优化培养基中镁、锰、亚铁、 锌离子和维生素的含量以与CO2与H2的比例、氟乙酸的浓度，A. succinogenes FH-7发酵产丁 二酸浓度达到73 g/L采用酸解和酶解法，玉米秸秆先经180 C汽爆10 min,再用0.4%硫酸 高压水解，水解后固体局部用纤维素酶和半纤维素酶在50 C下酶解72 h,合并两局部水解 液, 2000 g干秸秆共得到154 g木糖和293 g葡萄糖用A. succinogenes S.JST的pta-adh突变株 M.JSTA,在10 L发酵罐中发酵，总糖浓度为64 g/L,发酵液积累丁二酸56 g/L。
此外，有报道日本地球环境产业技术研究机构成功地使用转基因棒状杆菌，从废纸中制 取出琥珀酸，最终可从每升培养液中提g基于这一生产本钱，上述的丁二酸衍生物比目前 石化原料生产的有竞争力或接近有竞争力发酵法生产的丁二酸通过多年的实验，以与不同 国家公司中试的实践，在技术、环保、安全、经济等指标的考核均已经成为一个共识，这个 工艺线路有潜力成为大量生产化学制品，也可作为大局部重要的中间产物和专业化学制品得 根底上述文献报道的研究结果反映了利用这些廉价的原料生产丁二酸，具有良好的可行性 和应用前景〔4〕发酵法生产丁二酸的提取研究进展与石化法工生产丁二酸相比，采用生物发酵法可降低一些生产本钱，其中别离提取技术 大约占总生产本钱的 50%廉价生物质如木质纤维素的应用虽能降低发酵本钱，但也向发 酵液中引入更多的外来成分，包括蛋白质、木质素、果胶以与纤维素等，并且目标产物的浓 度通常比单糖发酵偏低，另外除了目标产物，发酵液中本身还存在一些其他的化合物，如代 谢副产物、细胞和残留的原料等，最终导致其下游别离过程比单糖发酵或化学合成更难规模 生产目前微生物发酵生产丁二酸的别离方法主要包括以下几种：沉淀法、电渗析法、溶剂 萃取法以与离子交换法。
4・1沉淀法沉淀法主要包括钙盐法、铵盐法以与近来研究比拟多的酯化法4.1.1钙盐法通过参加氢氧化钙或氧化钙生成沉淀，以达到从发酵液中别离的效果，是传统工业上别 离羧酸的常用方法钙盐法的具体步骤如下：先参加氧氧化钙或氧化钙，将得到的丁二酸钙 盐从发酵液中过滤别离出来，用浓硫酸处理，得到副产物硫酸钙，游离的酸通过一些方法〔如： 活性碳、离子交换等〕进展纯化，最后蒸馏得到丁二酸晶体〔图4.1〕钙盐法因为工艺成 熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用但经过这么多年 的应用，其缺陷日益显露：一是得到的提取液中丁二酸质量分数较低，增大了后续浓缩段的 负荷；二是单元操作损失多，总收率低；三是在提取过程中丁二酸经历了屡次相变，消耗化 工原料多，固液别离量大，能耗高；四是环境污染严重，产生大量的固体废弃物CaSO4,每 生产出1 mol的丁二酸产品，就产生出等摩尔的石膏副产物因此，钙盐法提取有待于进一 步的提高图4.1钙盐法提取流程简图4.1.2铵盐法Berglund和Dunuwila 1在美国专利中，提出一种即不消耗大量试剂，也不产生大量副产物 的生产和纯化丁二酸的工艺，在生产过程中硫酸铵副产物可实现循环利用。
生产与纯化的第 一步是种子接种到发酵罐中，用NaO H调节发酵液的PH6.0以上，在P H为7.0的时候最优第 二步是通过过滤器，将不溶的蛋白质和杂质除去得到的丁二酸钠质量分数为10%左右，通 过多效蒸发器浓缩至50%,在结晶器中，通入CO2与氨气，将丁二酸钠盐转化为丁二酸铵盐,然后在丁二酸结晶器中，参力nNH4HSO4将PH调为1.5〜1.8,进展结晶在这个PH下，丁二酸 的溶解度最小，而且丁二酸铵与硫酸氢铵反响生成硫酸铵和丁二酸，所以丁二酸能析出来 通过过滤器，洗涤，再通过甲醇纯化器，将丁二酸从相对不溶的硫酸盐中别离出来，最后蒸 发，可以得到纯的丁二酸甲醇蒸发，被回收到甲醇贮罐中从结晶器出来的NaHCO3可以 被用来调节发酵罐的PH从过滤器出来的滤液含有(NH4)2SO4、残留的丁二酸、NH4HSO4 与硫酸，与甲醇纯化器中出来的硫酸盐一起进入热分解器中这个过程是为了将残留的丁二 酸从硫酸盐中别离出来，以减少送入热分解器中的硫酸盐混入有机物，在分解过程中造成焦 化硫酸盐大局部为硫酸铵，局部为残留的硫酸氢铵和硫酸，将其置于热分解器中，温度维 持在300 r左右在这个温度X围内，硫酸铵裂解成为氨和硫酸氢铵，也可能形成硫酸。
硫 酸氢铵、残留的硫酸和残留的未分解的(N H4)2SO4可循环到丁二酸结晶罐，氨可加到结晶罐 中将钠盐转化成铵盐结晶器中出来的滤液包含甲醇和残留的丁二酸，在甲醇别离器中蒸馏后，残留的丁二酸 和一些硫酸盐水溶液与发酵罐出来的稀丁二酸二铵溶液混合一起进入多效蒸发器浓缩这样 就完成了一个闭合的清洁生产流程，整个工艺流程中，结晶的丁二酸是唯一的产物〔图4.2〕 目前铵盐法提取工艺流程只是实验阶段，是利用模拟体系的丁二酸通过铵盐法提取收率 达到94.9%，硫酸的回收率为96.7%，甲醇的回收率为94.9%铵盐法路线长，结晶过程条 件比拟苛刻，还需要高温裂解硫酸盐，步骤繁琐，难度大，操作费用高，增加了运行本钱, 不利于发酵制备丁二酸的规模化生产NnirCO]结晶器TIT]砒H［絶打屮母誥发器一【•撤洛晶器PH 15-1S甲醉蕴■发貉品的丁二® 钠｛10竹)*亠 ・发器图4.2铵盐法提取流程简图4.1.3酯化法在生物发酵法产丁二酸的发酵液中，丁二酸以盐的形式存在(微溶于醇溶剂)，加酸使丁 二酸盐酸化为丁二酸与水合盐(不溶于醇溶剂)，参加醇溶剂后盐析形成沉淀，同时丁二酸与 醇溶剂发生酯化反响，溶于醇溶剂中。
此酯化反响是可逆反响，将醇溶剂蒸馏除去，余下的 晶体即为生物基丁二酸反响式如下：HOOCCH 2CH2COOH + C2H5OH HOOCCH 2CH2COOC 2H5+H2O (1) HOOCCH2CH2COOC2H5+ C2H5O^ =C2H5OOCCH 2CH2COOC2H5 +H2O (2) 反响式(1)、(2)均为可逆反响，当醇过量时，反响向正反响方向进展；当醇不足时，反响向 逆反响方向进展，由此达到别离纯化生物基丁二酸的目的4.2溶剂萃取法溶剂萃取技术用于别离提取发酵制得的生物制品已经有几十年的历史，并且在过去20 年中对以发酵为根底的产品的生产技术的改良起了一定作用溶剂萃取技术的原理主要是利 用发酵液中丁二酸和其他杂质组分在萃取剂中的溶解度不同，把丁二酸萃取到溶剂相中再 经过减压浓缩，结晶，枯燥最后得到产品目前常用的萃取剂大多是叔胺类，主要有三丙胺 (TPA)、三丁胺(TBA)、三戊胺(TPcA)和三辛胺(TOA)Won Hi Hongt等人报道了通过液液萃 取的方法，以TOA为萃取剂，可以选择性的将乙酸从发酵液中除去，控制PH5.0时，可以将 丁二酸/乙酸的 比例由 原来的4.9变为9.4。
2006年，Yun Suk Huh利用Mannheimia succiniciproducens葡萄糖为碳源发酵生产丁二酸，通过溶剂萃取法，收率可以达到73.1%, 纯度达到99.8%，其工艺流程〔图4.3〕使用这种方法的缺点是在提取过程中需使用大量有 机溶剂同时，在食品级和医药级产品的生产中将对最终产品的质量有不良影响文献中还 没有关于采用三辛胺进展大规模生产的本钱问题以与三辛胺是否能够回收利用的报道萃取液图4.3萃取法提取流程简图4.3离子交换吸附法在上世纪七、八十年代，离子交换吸附法开始应用于发酵液中有机酸的别离提取它是利用特定的有机高分子树脂的高选择离子交换性，通过寻找、使用适宜的树脂，直接从处理 后的发酵滤液中提取有机酸或其盐类国内一般的流程是将发酵液经过滤后用离子交换柱交 换吸附，氨水洗脱后过阳离子交换柱转型，再经活性炭脱色、除杂后浓缩，结晶，最后得到 有机酸产品目前，对于离子交换吸附法提取丁二酸的报道较少，只有Brian H.Davison等人研究了在 模拟体系中丁二酸的提取，他们筛选出两种弱碱性阴离子树脂XUS40285和XFS40422,表现 出对丁二酸有较好的吸附容量，同时可以将丁二酸和发酵副产物完全分开，利用盐酸来洗脱， 可以使丁二酸的浓度由初始浓度10g/L提高到40〜110g/L，该树脂再生后，操作10个周期，并 且间歇操作的收率达到95％以上。
离子交换吸附法工艺简单，与钙盐法相比，由于减少了丁二酸的相变过程，能耗大大降 低；生产过程中不产生大量的石膏废渣，大大降低了工人的劳动强度，也改善了周围环境； 重要的是提高了丁二酸的收率当然，该工艺也存在一些缺点，例如，离子交换树脂在使用 中需要频繁再生，会产生大量废水；再之，离子交换树脂具有一定的寿命，也需要经常更换， 会产生大量的固体废弃物因此，寻求或研制高效、寿命长、易回收利用的离子交换树脂， 废液的循环利用或零排放，就成为该工艺得以工业化推广的关键4.4 固体膜别离法用于发酵有机酸别离提取的固体膜别离法主要有两种——超滤法和电渗析法4.4.1 超滤法超滤是一种以压力差为推动力，按粒径选择别离溶液中所含的微粒和大分子的膜别离操 作，只是简单的物理别离过程该工艺简单，易于控制，且不会产生污染它的关键是选择 适宜孔径的耐酸超滤膜，由于其易堵塞，所以超滤法一般只作为一种预处理手段，截留发酵 液中的大分子有机物，如残糖、蛋白质、未发酵的原料颗粒等，以减轻后续提取工序的污染n的微滤膜过滤，然后用超滤膜超滤，再用活性炭脱色除杂，得到澄清的丁二酸溶液， 调丁二酸溶液PH2.0〜3.5，浓缩，结晶得到丁二酸产品，通过这些步骤，结晶前丁二酸收率 达到75％〜80％，丁二酸的纯度达到99.5％以上。
4.4.2 电渗析法电渗析法是一种高效的膜别离技术，它的工作原理是利用阴阳离子交换膜的选择透过 性，在电场力的作用下，分别将混合液中的丁二酸根和氢离子别离出来，生成丁二酸图4.4 是进展两极膜电渗析的工艺流程简图发酵完毕后的混合丁二酸盐与乙酸盐溶液经过滤后， 进入两极电渗析单元，在这里离子和非离子局部（糖）与大分子物质（蛋白质和多糖）分开电 渗析膜包含离交局部，有一固定的电荷有固定正电荷的膜选择性地允许酸根离子通过而排 除钠离子，负电荷的膜选择性的允许钠离子通过而排除酸根离子，通过这一机制，可以将盐 和其它不带电荷的糖、蛋白质与氨基酸别离开，然后打入分批地两极膜电渗析单元，在这里 离交转变成他们相应的酸与其它形成的碱，然后分开两极膜是一种新型的膜，它能在水溶 液中使水产生质子和氢氧根离子,并能使离子向相反电荷的电极迁移随着这一过程的进展, 丁二酸钠被转变成丁二酸钠离子通过阳离子膜和氢氧根结合形成氢氧化钠，可重新用于发 酵罐中的中和反响通过两极电渗析膜后，丁二酸和乙酸得到浓缩，而且由于乙酸的存在加速了丁二酸的结 晶然后通过固液别离，丁二酸变为结晶产品母液经过乙酸.水溶液别离系统，除去乙酸, 剩余的溶液回收到种子罐中继续发酵。
通过该法提取的丁二酸的收率92%,纯度达到99.9% 这种方法的缺点是操作费用相当高，如膜的消耗和电渗析中的电能消耗此工艺的另一局限 性是不能处理二价离子，因此，发酵过程中用氢氧化镁或氢氧化钙中和的发酵液不能用这种 方法酸化或纯化图4.4两极膜电渗析提取工艺简图表4.1不同提取丁二酸方法的比拟提取方法优点缺点钙盐沉淀商业化可行，操作费用大，消耗大量的化学品，并且没法循环使钙盐法技术风险低，商业化应用，产生的副产物硫酸钙价值低，还需要增加其处用成熟理本钱铵盐法副产物少，所有化学试咼能耗，设备要求咼，设备本钱昂贵，技术风险咼，剂都可以重复使用需要技术验证酯化法回收率咼，纯度咼操作复杂，能耗高萃取法咼生产力和低能耗，易 于放大在进展络合萃取之前必须要除蛋白和除盐离子交换吸便于放大用于实际发酵液时常常吸附量低，再生困难，再生附法频繁，需要消耗大量的酸碱和水膜别离法纯度和回收率咼膜污染严重，膜的损耗高，不能将葡萄糖别离，设 备费用昂贵不同提取丁二酸方法的优缺点比拟如表4.1所示综上所述，目前对从发酵液中提取丁word二酸的研究趋势是：一方面从单纯的提取丁二酸扩展到直接制备丁二酸衍生产品；另一方面 寻找操作简单、废物排放少、能耗低的提取方法，从而达到降低提取过程的本钱，减少提取 过程产生的污染。
〔5〕需要解决的问题虽然国内外对微生物发酵产琥珀酸进展了大量的研究，但是仍然存在着较多的科学问题 制约着微生物发酵产琥珀酸的工业化生产，主要科学问题如下：〔1〕除 E. coli 外，其余产 琥珀酸菌株的代谢框架已经根本构建，但是代谢网络不完善在 A.succinogenes 的代谢研究 中，美国密西根州的生物技术研究最先公布了经16SrRNA鉴定的A.succinogenes，也最先 研究了该菌株的代谢框架，但是其代谢通量数据不够完善，且该类菌种的关键代谢调控仍有 很多未知的地方，如各个途径在不同条件下的代谢流如何分配等问题〔2〕对产琥珀酸菌株内的H供体代谢平衡机理缺乏深入研究作为微生物细胞内一个 重要的代谢中间体，琥珀酸的生成需要消耗大量的H供体，尽管GuettlerMV等开展通入 H2 的发酵试验， 但这对工业规模的发酵来说并不适用 对于 A.succinogenes 和 A.succiniciproducens， NADPH 和 NADH 的产生机制并不明确，无法通过分子生物技术来加 强NADP+和 NAD+的再生，调节细胞内的复原力因此如何调节，使H供体代谢平衡是改 善细胞代谢参数的一个关键。
〔3〕有效降低代谢副产物的问题尚未得到很好的解决尽管对如何降低菌株副产物的 生成进展过众多的研究，但是对于微生物基因组信息了解很少的菌株〔除E. coli基因工程 菌外〕，无法从基因的水平上彻底降低菌株副产物的生成，因此研究者普遍没有能够采取有 效措施实现在不严格的发酵条件下有效降低副产物〔4〕目前虽然研究出许多工程菌种和生物原料可供于生产丁二酸，但是丁二酸生产强 度和转化率还需要进一步改善和提高，以满足工业化生产丁二酸要求，另外如何更高效的从 发酵液中提取丁二酸也是生产过程中一个重要的环节〔6〕生产丁二酸的本钱分析〔 1 〕原材料本钱——比率分析法原材料比率分析法是以生产原料的本钱和其转化率之比来衡量产品本钱的一种方法。