蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA2、 设计蛋白表达引物引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基3、 RT-PCR KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、 双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体5、 转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒6、 将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21 codon （DE3）等7、 蛋白的诱导表达1） 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=O.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25 uM 到1m M37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）2） SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带3） 将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围 甘油是用0.22 um过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量4） 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm）, 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡 萄糖用来抑制本底表达葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达2. 保种可以取一部分分成50 ul —管，每次用一管，避免反复冻融8、 包涵体检测方案见附件29、 如有上清表达，则扩大摇菌1） 取保种的表达菌株先摇10ml， 37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种 的活性而异，也可过夜摇菌2） 将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h），然后加IPTG （浓度同包涵体检测中使用的浓度注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可另一方法是，将手指放在瓶底 晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响3） 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右4） 将菌液6000rpm，4min，4度 离心收集菌体加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓 冲液重悬每250ml菌液用30 ml到50ml平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。
可用 4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存10、 超声波裂解1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可注意：1•要冰浴2•要随时观察裂解情况以防意外3•要将探头探入到溶液中下部， 尽量不要打出大量气泡一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡4•正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后 面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）5.超声波破碎仪工作30分min要休 息5min （即关闭总电源开关）注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂 （PMSF），PMSF工作浓度为1%2•如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解 60分钟，60分钟足够裂解11、 取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中10000rpm, 15min, 4°离心沉淀为包涵 体、细胞碎片和未破碎的细胞轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀此时可 以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后 上清就会在7.5左右。
12、 纯化上清---摸洗脱条件1） 镍柱处理将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml2） 将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次若是流 速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散取20 ul过柱后 的样品，以备跑胶3） 分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白每个梯度分别 的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别 收集入EP管中，以备跑胶注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行 下一个梯度的洗脱实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗 脱了4） 加Elution Buffer将目的蛋白洗脱上样量为4.5ml （将前面的0.5ml单独接入EP 管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品5） 加MES将NI柱重生MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次尿素可能对NI柱有损伤注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。
镍柱所用溶液 MES 的 ph=5.0,其余 Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ， Elution Buffer pH=7.213、 跑胶验证1） 跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相 同两块胶才会比较一致2） 跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、 W7、W8、W9、E1、E2、MES3） 300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右也可以300V,30min,只是 图没有160V好看4） 考马斯亮蓝染色一般染色2h即可5） 脱色先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜14、 纯化上清---收集目的蛋白1） 将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）2） 重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗15、 跑胶验证同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好16、 透析1） 配制2L透析液（配方见附件1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。
2） 透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净3） 用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其 中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中冰浴下轻微磁力 搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液透析3次即可注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中冰浴以防活性降低17、 浓缩1） 将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋2） 30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇3） 每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩4） 透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状， 透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细如果看不到，可根据自己估 计的蛋白量留l-2ml体积用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶 液分装后-20度保存18、 超滤法浓缩、透析蛋白使用超滤法就可省去16、17两步1） 将4ml Elution得到的蛋白溶液加入超滤管中。
2） 配平3） 7400g， 30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右浓缩4倍可根据需要选择 不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数可以几次的Elution液一起浓缩4） 加入需要的蛋白储存液至4ml，离心重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋 白储存液蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl 溶液如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶5） 收集将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白 浓度（测量后），制备日期注：超滤管的使用方法见附件419、 蛋白浓度测定见附件320、 蛋白活性测试转染细胞测量荧光21、 抗原处理蛋白和弗氏佐剂混合成油包水状22、 注射兔子选择合适的注射方式和合适的免疫程序23、 收集免疫血清提取抗体24、 抗体效价评定 附件1所需溶液配方：1） 20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g） 1L0. 59285.80219217.5322) Equilibration Buffer (平衡缓冲液)：PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.43) Wash Buffer(清洗缓冲液)：PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 pH 7.44) Elution Buffer (洗脱缓冲液)：PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.45) MES (再生缓冲液)：20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。
即卩 0.3904g MES+0.5844g NaCl.6) 透析袋处理液：2% (w/v)碳酸氢钠和1 mmol/L (pH8.0) EDTA7) 透析液：20mM PBS+50 mM NaCl (2.92g)试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g） 1L0. 59285.8021922.92gTIPS:1—4的溶液可以一起配制先配10ml 8M的咪唑再配1L的PBS，用500ml水将 试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为 Wash Buffer、Elution Buffer 和 Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的 8M 咪唑 最后，定容Wash Buffer、Elution Buffer 各配了 100ml， Equilibration Buffer 配了 300ml PBS 配了 500ml附件2包涵体检测1. 摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性培养至0D600=0.5后离心加入新的培养基和相 应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）。
在 离心前取500 M 1菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照正负对照不用 超声波裂解，直接煮沸1 Omin跑胶2. 诱导完成后，用 2ml EP 管 6000rpm, 2min, 4 度，收集 10m 1 菌液1.5m1PBS （50m M PBS,300m M NaCl ）重悬细菌3. 裂解细胞 用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min裂解3s,停止6s,裂解时冰上放置4. 分离上清5000rpm, 4min, 4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片然后，10000rpm, 10min, 4度取上清于新的1.5mlEP管中取其中的20微升于200微的EP管中，加5 微 5*SDS loading buffer 混匀，煮沸 10min5. 重悬包涵体用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微 5*SDSloading buffer，煮沸 10min6. 正负对照的收集离心收集正负对照菌体,0.5ml上清留下40 Ml,加入10 M 15*SDSloading buffer,煮沸 10min 裂解7. 跑聚丙烯酰胺凝胶将正负对照及实验样品一起跑胶。
一般顺序是-,+,上清，包涵体. 附件3蛋白浓度定量测试方案1将染色剂稀释稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44 M m的滤膜过滤于另50ml离心管中此剂量可测4个样品2.牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备1） 将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml,分装为400-500 M l/±（可以 室温放置60天，-20度长期保存）2） 将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/m 1,各180 Ml,另外加一管水为零对照浓度0.2mg/ml0.4 mg/ml0.6 mg/ml0.8 mg/mlBSA (1mg)36 Ml72 Ml108 Ml144 MlH2O144 Ml108 Ml72 Ml36 Ml3. 染色1） 取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中4个 梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品（或1+n个样品）和1个blank,共10支 EP管（或10+n支），分别对应标记2） 将30 Ml样品和30 Ml标准BSA及30 Ml H2O分别加入上述EP管中。
涡旋混匀3） 室温孵育5min到60min5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为 Absorbance wil increase over time4. 吸光度的测量600nm处测量，并记录吸光度注意：1. blank是染色液加30微升的水2.从低浓度测量到高浓度根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample 的测量顺序5. 比色皿的洗涤用100%乙醇浸泡洗涤6. 标准曲线的制作利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线 附件4.4ml millipore超滤离心管使用注意事项1. 用前用miliq水润湿2. 4度预冷3. 离心力不能超过7500g加速度设定为8.4. 离心时将离心管的两膜片竖直到和地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一 致5. 使用完毕后，用miliq水洗净，加入lml 0.1N NaOH泡24h,后加入lml20%乙醇保存 如果要短期保存几天，也可加水浸泡附件5聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法附件6.包涵体蛋白的提纯和提上清中所用试剂不同之处：在 Equilibration Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer 中各加了 6M尿素或盐酸胍。
尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白在裂解完后，离心时先 3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体 用加了 6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体后面的步骤跟提上清蛋白一致， 只是所用 Equilibration Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer 中都含有 6M 尿素或盐酸胍另 外盐酸胍会和SDS结合形成沉淀，影响跑胶这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶如果要做包涵体，建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去，除去后蛋白可能 就析出了尿素毒性相对较小，可以不用除去这样可以省去很多麻烦尿素对包涵体的溶 解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解：6mm变幅杆，15%功率， 3s/6s， 10min左右即可也可以加上1%---5%的甘油助溶甘油是加在Equilibration Buffer 中的另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0.6 左右乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE1、 1.5mlEP管中加150 ul蛋白溶液和1350 ul 100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。
2、 -20度放置10min4度，15000rpm， 10min，小心弃去上清，尽量去干净此时管底可 见蛋白沉淀3、 向管中加30 ul 1.5*SDS-loading buffer这里蛋白溶液已经浓缩了 5倍）4、 上样，跑胶如有错误，敬请批评指正血清的提取动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g， 10min离心，分离出血清 抗血清保存有三种方法：第一种是4°C保存，通常可保存3个月〜半年，效价高时可保存一年左右；第二种是-20C〜-40C低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；第三种是真空冰冻干燥保存，可保存5〜10年注：耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会 溶血。