武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌及其检测技术军团菌及其检测技术武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科Email：2014年年11月月武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2 2军团菌的发现军团菌的发现l1976年年7月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中爆发了一种症状相同，原月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中爆发了一种症状相同，原因不明的细菌性肺炎，因不明的细菌性肺炎，有有221人感染疾病，其中死亡人感染疾病，其中死亡34人l初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空气传播，采集标本，分离初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空气传播，采集标本，分离病原体病原体l革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌嗜肺军团菌（嗜肺军团菌（L.pneumophila）l军团菌病军团菌病(已知的首次爆发已知的首次爆发)武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3 3Part I：军团菌及军团菌病军团菌及军团菌病武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4 4军团菌军团菌革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径浅红色的短杆菌，直径0.30.30.5m0.5m，长约，长约1.21.25m5m或更长，菌或更长，菌体一端有鞭毛体一端有鞭毛.在含在含L L-半胱氨酸和焦磷酸铁的半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYEBCYE琼脂培琼脂培养基上生长，通常需要在养基上生长，通常需要在3737 5%5%CO2培养培养箱箱培养培养2-102-10天。
天生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色紫色变为蓝色，或是灰绿色初步在初步在BCYEBCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性璃样，具有多型性.武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5 5军团菌科、属、种、血清型军团菌科、属、种、血清型u军团菌科军团菌科 (Legionellaceae(Legionellaceae）Legionella/Fluoribacter bozemanii/Tatlockia micdadeiLegionella/Fluoribacter bozemanii/Tatlockia micdadei u军团菌属：军团菌属：16s rRNA16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系分析表明，在蛋白细菌系亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群与引起群与引起Q Q热病的热病的coxiella burneti(coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。
细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞u军团菌种：现已发现军团菌种：现已发现5050个种（个种（speciesspecies），），7070多个血清型（多个血清型（serogroups)serogroups)，至少有，至少有2020个个种可引起人感染种可引起人感染武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科6 6种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979L e g i o n e l l a maceachernii 1985L e g i o n e l l a geestiana 1993L e g i o n e l l a bozemanae 1980Legionella parisiensis 1985L e g i o n e l l a londiniensis 1993L e g i o n e l l a dumoffii 1980L e g i o n e l l a rubrilucens 1985L e g i o n e l l a nautarum 1993L e g i o n e l l a gormanii 1980Legionella santicrucis 1985L e g i o n e l l a quateirensis 1993L e g i o n e l l a micdadei 1980Legionella spiritensis 1985L e g i o n e l l a worsleiensis 1993L e g i o n e l l a pittsburghensis 1980L e g i o n e l l a steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996L e g i o n e l l a longbeachae 1982L e g i o n e l l a birminghamensis1988L e g i o n e l l a waltersii 1996L e g i o n e l l a oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989L e g i o n e l l a taurinensis 1999Legionella wadsworthii 1983L e g i o n e l l a cincinnatiensis1989L e g i o n e l l a beliardensis 2001军团菌种军团菌种武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科7 7军团菌病军团菌病武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科8 8Part II：样本的采集与运输样本的采集与运输武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科9 9哪些环境中存在军团菌？武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1010标本的种类标本的种类u 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水温泉水,淋浴水淋浴水,加湿器水；加湿器水；u 病人组织标本病人组织标本:如痰如痰,支气管灌洗液支气管灌洗液,胸水胸水,血液等标本。
血液等标本武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1111环境标本采集原则环境标本采集原则最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水样，该水样即代表设备内最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水样，该水样即代表设备内的水过后流出的水标本：最初流出的水标本收集以后，让设备内的水流掉后再采集过后流出的水标本：最初流出的水标本收集以后，让设备内的水流掉后再采集水样此水代表供给设备的水此水代表供给设备的水武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1212环境标本采集环境标本采集有杀生物剂时的采样：水样中含有氯或其它氧化性杀生物剂时，向采样瓶中添有杀生物剂时的采样：水样中含有氯或其它氧化性杀生物剂时，向采样瓶中添加适量硫代硫酸钾使其灭活对于其它的生物剂，加入普通的中性试剂是无效加适量硫代硫酸钾使其灭活对于其它的生物剂，加入普通的中性试剂是无效的注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的间隔时间控制在注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的间隔时间控制在14天以内样本的来源，数量，有无杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室不知来样本的来源，数量，有无杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。
不知来源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1313常见几种系统采集部位常见几种系统采集部位冷水系统的采集：冷水系统的采集：进水系统进水系统蓄水池蓄水池与每个蓄水池相连的下水道的排出口与每个蓄水池相连的下水道的排出口蓄水池最远的下水道的排出口蓄水池最远的下水道的排出口 对每一个装置来说，收集对每一个装置来说，收集500ML最初流出的水标本，让水持续流，并在流水中最初流出的水标本，让水持续流，并在流水中放一只温度计，待温度稳定后，收集放一只温度计，待温度稳定后，收集500ML过后流出的水标本过后流出的水标本武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1414热水系统热水系统加热器的排出口：选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备加热器的排出口：选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备关掉离加热器最近的冷水系统关掉离加热器最近的冷水系统避免冷热水混合避免冷热水混合加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥排水口连接一根干净的硅胶管排水口连接一根干净的硅胶管 采样方式：打开开关采集最初流出的水标本。
让水排掉至温度稳定为止再采采样方式：打开开关采集最初流出的水标本让水排掉至温度稳定为止再采一份过后流出的标本，并关闭开关一份过后流出的标本，并关闭开关武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1515淋浴器淋浴器收集最初流出的水标本收集最初流出的水标本如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的未用过的塑料袋，该装置如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的未用过的塑料袋，该装置包裹起来，切掉一个角，将该切口处置于接取标本容器的开口处包裹起来，切掉一个角，将该切口处置于接取标本容器的开口处武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1616冷却塔冷却塔警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉冷却塔的鼓风机警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉冷却塔的鼓风机戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器继续运行而不能关闭冷却塔时，戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器继续运行而不能关闭冷却塔时，则需要采样人员做出专门的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防则需要采样人员做出专门的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。
护装备在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用吸取顶部蓄水池在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用吸取顶部蓄水池的水先用水充满管子并夹住其一端，以防止管子空了管的一端放在蓄水池的水先用水充满管子并夹住其一端，以防止管子空了管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端松开夹子，里，另一端放在采样瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端松开夹子，水开始流出，取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出水开始流出，取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1717进水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度进水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度20cm)，用虹吸管采取池子深处的粘泥采集位于该系统内滤器的水，沉淀物，用虹吸管采取池子深处的粘泥采集位于该系统内滤器的水，沉淀物，碎砾等注意：所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理位置如果蓄水池和水塔注意：所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理位置如果蓄水池和水塔之间的管道短，那么只需采集一份标本。
之间的管道短，那么只需采集一份标本武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1818标本的运输和相关生物安全要求标本的运输和相关生物安全要求u 在周围环境温度下运送水样标本在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻不必冷冻,但要防止受热和阳光但要防止受热和阳光,标本要尽可能标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室快或最好在两天内送到实验室,室温下室温下(21(21+3)3)贮藏在实验室或其他地方贮藏在实验室或其他地方u 对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20-20冻存备用冻存备用武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科1919军团菌操作生物安全性军团菌操作生物安全性u 应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定u 生物安全生物安全级实验室，最好在安全柜中操作级实验室，最好在安全柜中操作u 操作人员培训操作人员培训u 菌种保存菌种保存武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2020可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定病原菌名称病原菌名称危害程度危害程度分类分类实验活动所需生物安全实验室级别实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类运输包装分类学名学名中文名中文名大量活菌大量活菌操作操作动物感动物感染实验染实验样本样本检测检测非感染性非感染性材料实验材料实验A/BUN 编编号号Legionella pneumophila嗜肺军团嗜肺军团菌菌第三类第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2121Part III：军团菌的分离与检测：军团菌的分离与检测武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2222水样标本中军团菌的分离方法水样标本中军团菌的分离方法检测依据检测依据:公共场所集中空调通风系统卫生规范公共场所集中空调通风系统卫生规范中的集中中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录检验方法见附录B B。
适用于各种环境标本军团菌检测适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括：，包括：饮用饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质淀物、软泥等物质武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2323标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水样血清水样处理与制备血清学检测方法：*间接荧光抗体染色法*试管凝集试验*ELISA法接种军团菌BCYE培养基接种军团菌选择性GVPC培养基37，5%CO2，培养3-14天挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检37,5%CO2,培养3-14天革兰氏染色阴性杆菌革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验 尿液抗原检测武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2424军团菌水质检测概括军团菌水质检测概括采样采样浓缩浓缩培养培养分离分离鉴定鉴定武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2525实验所需仪器设备实验所需仪器设备90mm平皿平皿3537孵箱孵箱滤器（大的不锈钢制成的滤器）滤器（大的不锈钢制成的滤器）正压膜蠕动过滤泵：流速可调。
正压膜蠕动过滤泵：流速可调3升升/分钟分钟注意：样本量少，也可用真空辅助的滤过系统代替注意：样本量少，也可用真空辅助的滤过系统代替膜滤器：膜滤器：0.22um或或0.45um水浴锅：水浴锅：离心机：离心机：涡旋振荡器：涡旋振荡器：显微镜：显微镜：武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2626军团菌检测所需准备基本试剂军团菌检测所需准备基本试剂培养基（培养基（GVPCGVPC，BCYE,BCYE-CYS)BCYE,BCYE-CYS)试剂试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液）生化试剂、甲醛的盐溶液）酸缓冲液（酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（，碱缓冲液（0.03mol/L KOH）血清学试剂血清学试剂武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2727培养检测所需准备材料培养检测所需准备材料直径大约为直径大约为90mm90mm或或100mm100mm的无菌培养皿的无菌培养皿培养箱，培养箱，COCO2 2能够恒温保持在（能够恒温保持在（36361 1）水浴箱，能够保持在（水浴箱，能够保持在（50501 1）显微镜或荧光显微镜。
显微镜或荧光显微镜武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2828样品采样准备材料样品采样准备材料玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理水样一般采集为玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理水样一般采集为250-500ml250-500ml，收集在容器瓶，收集在容器瓶中如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于7070）或蒸汽进）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于行巴斯德氏消毒，时间不低于5 5分钟小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖灭菌棉拭子灭菌棉拭子一般建议用塑料包装的容器一般建议用塑料包装的容器武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科2929军团菌培养基军团菌培养基Muller-HintonMuller-Hinton琼脂琼脂第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代CYECYE琼脂琼脂CYECYE琼脂加入琼脂加入-酮戊二酸酮戊二酸BCYEBCYE琼脂琼脂BCYEBCYE琼脂中含有选择性抗生素琼脂中含有选择性抗生素GVPCGVPC琼脂琼脂武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3030军团菌培养基军团菌培养基武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3131军团菌分离培养用军团菌分离培养用BCYEBCYE培养基培养基酵母浸出物酵母浸出物10.0g 活性炭活性炭2.0g琼脂琼脂17.0g 酮戊二酸酮戊二酸1.0g蒸馏水蒸馏水950 mL半胱氨酸盐酸盐半胱氨酸盐酸盐0.4g可溶的焦磷酸铁可溶的焦磷酸铁0.25g半胱氨酸和焦磷酸铁分别溶于10 mL蒸馏水，分别过滤（0.45 m滤器）。
将剩余培养基成分溶于950 mL蒸馏水，高压灭菌水浴冷却至50，加入上述过滤液10 N KOH调整pH至6.9蒸馏水补充至1L倒培养基前先摇动混匀以保持碳呈悬浮状态每平板20ml（15100mm），斜面10ml或4ml（20150mm或13100mm）ACES缓冲液(2 乙酰基 2 氨基乙烷磺酸)10.0g武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3232选择性（选择性（GVPCGVPC）培养基的制备）培养基的制备添加四种抗生素：添加四种抗生素：甘氨酸甘氨酸3g/L（稳定剂，防腐剂，缓冲剂）（稳定剂，防腐剂，缓冲剂）多粘菌素多粘菌素B（硫酸盐）（硫酸盐）79200iu/L（抑制大肠肺克，百日咳等）（抑制大肠肺克，百日咳等）万古霉素（盐酸盐）万古霉素（盐酸盐）0.001g/L（金葡，化脓性链球菌，白喉，肺链，炭疽等）（金葡，化脓性链球菌，白喉，肺链，炭疽等）放线菌酮放线菌酮0.08g/L（杀真菌，致畸，）那他霉素也可代替之杀真菌，致畸，）那他霉素也可代替之武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3333抗生素的配制抗生素的配制多粘菌素多粘菌素B：200mg加入加入100蒸馏水中，混匀后，蒸馏水中，混匀后，.uM滤器过滤除菌，以滤器过滤除菌，以5.5量分装到无菌瓶内，冷冻保存。
用时在室温下孵化量分装到无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化万古霉素：万古霉素：20mg加入加入20蒸馏水中，混匀后蒸馏水中，混匀后.uM滤器过滤除菌，以滤器过滤除菌，以ML量分装量分装到无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化到无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化放线菌酮：放线菌酮：2g加入加入100蒸馏水中，混匀后，蒸馏水中，混匀后，.uM滤器过滤除菌，以滤器过滤除菌，以4 ML量分装量分装到无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化到无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化注意：放线菌酮具有肝毒性，当处理这种粉末状试剂时，应该带手套和防尘口罩注意：放线菌酮具有肝毒性，当处理这种粉末状试剂时，应该带手套和防尘口罩武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3434GVPCGVPC培养基的制备培养基的制备 按上述按上述BCYE培养基的方法配制完成后，冷却至培养基的方法配制完成后，冷却至50 C时，分别添加已配制好时，分别添加已配制好的三种抗生素每种取一份剂量，充分混匀后即为最终选择性培养基的三种抗生素每种取一份剂量，充分混匀后即为最终选择性培养基武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3535BCYE-CysBCYE-Cys培养基培养基 为不含为不含L-L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。
按照配制半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基按照配制BCYEBCYE培养基的方法配培养基的方法配制，不加制，不加L-L-半胱氨酸半胱氨酸武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3636半成品培养基半成品培养基武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3737培养基的质控培养基的质控注意：消毒过程中，加热时间过长或温度过高，都能影响培养基的营养质量注意：消毒过程中，加热时间过长或温度过高，都能影响培养基的营养质量培养基成分每批间的差别（特别是培养基成分每批间的差别（特别是 酮戊二酸）也能影响其效能所以，检验酮戊二酸）也能影响其效能所以，检验各批次新配制的培养基是十分必要的孵育三天，观察其支持军团菌的能力来各批次新配制的培养基是十分必要的孵育三天，观察其支持军团菌的能力来判断选择新鲜培养的选择新鲜培养的LP1型参考菌株和分离到的型参考菌株和分离到的LP1菌株（勿超过菌株（勿超过10代）制成菌悬代）制成菌悬液，分别接种到新旧两个批次的培养基上孵育之后记录和比较结果，确保其液，分别接种到新旧两个批次的培养基上孵育之后记录和比较结果，确保其菌落形态和菌落数量是相同的。
菌落形态和菌落数量是相同的武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3838水样的正压膜过滤法水样的正压膜过滤法安放滤膜；安放滤膜；过滤；过滤；取膜；取膜；洗膜武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科3939水样浓缩物的贮存水样浓缩物的贮存最好对样品立刻进行分析；最好对样品立刻进行分析；标本于（标本于（6 62 2）储藏最多不超过储藏最多不超过1515天对于军团菌来说，如果储藏于对于军团菌来说，如果储藏于0 066，这种损失是最明显的而且，温度在，这种损失是最明显的而且，温度在2020或或2020以上时，异养生物的生长速度就会变快以上时，异养生物的生长速度就会变快武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4040两种处理方法两种处理方法热处理：将浓缩好的样品混匀后分别取热处理：将浓缩好的样品混匀后分别取1ml 于无菌管中，放到于无菌管中，放到50度水浴内保温度水浴内保温30分钟；分钟；酸处理酸处理:取适量浓缩好的样品混匀后离心，取适量浓缩好的样品混匀后离心，6000rpm10分钟灭菌管吸去上清，分钟灭菌管吸去上清，至原来一半的量。
再次重悬混匀，加入酸缓冲液至原来的量，并轻轻混匀，室至原来一半的量再次重悬混匀，加入酸缓冲液至原来的量，并轻轻混匀，室温下静置温下静置5分钟，备用分钟，备用武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4141选择培养基的接种选择培养基的接种将将100ul浓缩好的但未经任何处理的标本接种到浓缩好的但未经任何处理的标本接种到GVPC平板上，用无菌接种环将液体均匀平板上，用无菌接种环将液体均匀涂布在整个培养基表面涂布在整个培养基表面用同样的方法，从水浴中取出热处理的标本，吸取用同样的方法，从水浴中取出热处理的标本，吸取100ul接种到接种到GVPC平板上同样，经酸处理的立即接种同样，经酸处理的立即接种武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4242接种标本培养接种标本培养u 接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（36361 1）培养培养7-7-1010天u 为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子在每次观察为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。
在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）u 在含在含2.5-5.0%CO22.5-5.0%CO2的环境下培养有利于军团菌的生长的环境下培养有利于军团菌的生长武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4343平板的检查平板的检查培养时间内，培养时间内，48小时后，每天观察菌落生长情况小时后，每天观察菌落生长情况军团菌菌落通常呈灰白，灰绿，紫色和蓝色表面光滑，边缘整齐一种的菌落（博军团菌菌落通常呈灰白，灰绿，紫色和蓝色表面光滑，边缘整齐一种的菌落（博杰曼军团菌，高曼，杜莫夫等）能自动发出白色耀眼的荧光杰曼军团菌，高曼，杜莫夫等）能自动发出白色耀眼的荧光武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4444孵育不同时间菌落生长情况孵育不同时间菌落生长情况武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4545军团菌菌落特点（军团菌菌落特点（1 1）u军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色u一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。
一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观u在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4646军团菌菌落特点（军团菌菌落特点（2 2）u 嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色u 为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间不能超过规定时间u 值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别有的特征可能会和上述特征有所区别武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4747可疑军团菌菌落的进一步鉴定可疑军团菌菌落的进一步鉴定BCYEBCYE或其他培养基上传代培养或其他培养基上传代培养革兰染色镜检革兰染色镜检生化鉴定生化鉴定PCRPCR检测军团菌特异性基因片段检测军团菌特异性基因片段免疫荧光的方法确定军团菌的种类免疫荧光的方法确定军团菌的种类 武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4848BCYEBCYE或其他培养基上传代培养（或其他培养基上传代培养（1 1）至少从每块至少从每块GVPCGVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYEBCYE和和BCYE-CysBCYE-Cys培养基上培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。
传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行在（在（36361 1）至少培养两天至少培养两天凡是在凡是在BCYEBCYE培养基上生长而在培养基上生长而在BCYE-CysBCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科4949BCYEBCYE或其他培养基上传代培养（或其他培养基上传代培养（2 2）u 营养琼脂或血琼脂培养基可以代替营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-CysBCYE-Cys培养基如果在这三种培养基上都培养基如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养u 橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-L-半胱氨酸和铁离子，但半胱氨酸和铁离子，但随后在随后在L-L-半胱氨酸缺失时生长微弱半胱氨酸缺失时生长微弱武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5050BCYEBCYE培养基上传代培养培养基上传代培养BCYE 血平板BCYE不含半胱氨酸武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科革兰染色镜检革兰染色镜检军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。
短杆状长丝状武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5252军团菌生化鉴定军团菌生化鉴定生化试验结果触酶/弱+氧化酶-/+硝酸盐还原-尿素酶-明胶液化+水解马尿酸+淀粉水解弱+武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5353确定军团菌的种型确定军团菌的种型 Oxoid Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出：的乳胶试剂盒可以鉴定出：嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清1 1型型;嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清2-142-14混合型；混合型；L.longbeachae1L.longbeachae1和和2 2型型 ，L.bozemanii1L.bozemanii1和和2 2型，型，L.L.dumoffii dumoffii，L.gormaniiL.gormanii，L.jordanisL.jordanis，L.micdadeiL.micdadei，L.anisaL.anisa混合型武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5454确定军团菌的种型确定军团菌的种型-1-1在进行鉴定试验前，要保证在在进行鉴定试验前，要保证在BCYEBCYE培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。
培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌属的鉴定，属的鉴定，16sRNA16sRNA武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5555嗜肺军团菌的确定嗜肺军团菌的确定 应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌有条件的可做嗜肺军团菌特异应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌有条件的可做嗜肺军团菌特异的的PCRPCR检测生化培养：氧化酶（生化培养：氧化酶（/弱弱+），硝酸盐还原，尿素酶，明胶液化，水解），硝酸盐还原，尿素酶，明胶液化，水解马尿酸马尿酸,淀粉酶水解弱淀粉酶水解弱+血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型PCRPCR：mip,dnaJ mip,dnaJ 武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5656军团菌血清鉴定军团菌血清鉴定日本生研所Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5757结果表述结果表述为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（CFU/mlCFU/ml），从三块），从三块GVPCGVPC平板培养基中挑平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多的平板。
根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数选出已确定军团菌生长最多的平板根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数计算三个计算三个GVPCGVPC平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5858检验报告检验报告实验报告应包括以下信息实验报告应包括以下信息国际标准的参考国际标准的参考鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别物的种类、采样点的类别被检测标本的体积和数量被检测标本的体积和数量采样日期采样日期样品收集日期样品收集日期实验室接收日期实验室接收日期实验室检测日期实验室检测日期1.分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科5959菌株保存菌株保存短期保存短期保存 将军团菌接种在将军团菌接种在BCYEBCYE斜面培养基上，可以在斜面培养基上，可以在44保存数周。
保存数周长期保存长期保存 如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温冷冻保存法而冻干保存法因为在如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温冷冻保存法而冻干保存法因为在4 4 或或 20 20 存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的保存方法存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的保存方法武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科6060低温冷冻保存法低温冷冻保存法1 1、将军团菌接种在、将军团菌接种在BCYEBCYE平板上，平板上，363611，2.5%-5%CO2.5%-5%CO2 2培养箱或烛缸中培养，确培养箱或烛缸中培养，确定没有污染定没有污染2 2、将已灭菌的含有、将已灭菌的含有ACESACES、L-L-半胱氨酸和半胱氨酸和15%-20%15%-20%甘油的保存液分装至甘油的保存液分装至2ml2ml的螺帽冻的螺帽冻存管中，每管存管中，每管1ml1ml3 3、用灭菌棉签从、用灭菌棉签从BCYEBCYE平板上刮取适量细菌放入以上装有保存液的冻存管中注平板上刮取适量细菌放入以上装有保存液的冻存管中注意，使用的冻存管必须能耐受低温意，使用的冻存管必须能耐受低温。
4 4、将冻存管放入、将冻存管放入-70-70 冰箱保存也可以放于冰箱保存也可以放于-20-20冰箱，但是菌株存活率可能受冰箱，但是菌株存活率可能受影响武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科6161谢谢 谢谢 ！。