Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,,‹#›,,单击此处编辑母版标题样式,,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,课题3 血红蛋白的提取和分离,主要内容：,一、基础知识,二、实验操作,,一、基础知识---,蛋白质分离和提取的原理,㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）,2、概念：,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,3、原理：,,4、具体过程,一、基础知识---,蛋白质分离和提取的原理,,,分子量,大,小,直径大小,大于,凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面,小于,凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部,运动方式,垂直向下移动,垂直向下移动，无规则扩散进入,颗粒内部,运动速度,较快,较慢,运动路径,较短,较长,洗脱次序,先从,凝胶柱洗脱出来,后从,凝胶柱洗脱出来,一、基础知识---,蛋白质分离和提取的原理,,用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质,A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快,C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快,D,,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,B,,1、概念：,在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
㈡ 缓冲溶液：,2、作用：,能够抵制（ ）对溶液（ ）的影响，维持PH基本不变外界的酸或碱,pH值,,3、缓冲溶液的配制,通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液1－2,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲液NaH,2,PO,4,/ Na,2,HPO,4,H,2,CO,3,/ NaHCO,3,磷酸缓冲液，,保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察,(,红色,),和科学研究其,(,活性,),4、在本课题中使用的缓冲液？,,（三） 电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2.原理：,,①许多重要的生物大分子，如多肽、,核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离3.类型:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙稀酰胺,凝胶电泳。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,,4、,聚丙稀酰胺凝胶电泳,（1）聚丙稀酰胺凝胶：,是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N,，—,亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的,迁移率,取决于它所带,净电荷,的多少以及,分子的大小,等因素为了消除,净电荷对迁移率的影响，,可以在凝胶中加入,SDS2）原理：,,SDS能使蛋白质发生完全变性由几条肽链组成的,蛋白质复合体,在SDS的作用下会,解聚成单条肽链,，因此测定的结果只是,单条肽链的分子量,SDS能与各种蛋白质形成,蛋白质—SDS复合物,，,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子,原有电荷量,因而掩盖了,不同种蛋白质间的电荷差别,，使电泳迁移率完全取决于分子的大小3）SDS-,聚丙稀酰胺凝胶电泳,作用机理:,4、,聚丙稀酰胺凝胶电泳,,使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A 电荷的多少 B 分子的大小,C 肽链的多少 D 分子形状的差异,,,,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。
2）粗分离：透析除去分子较小的杂质3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定二、实验操作：,样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定,,血液,血浆,水 分,其他物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（90％）,两个,α－肽链,两个β一肽链,四个亚铁红素基团,1.,血液有哪些成分？,2.,你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？,二、实验操作：,样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定,知识回顾,,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：,,,,2、血红蛋白的释放：,,3、分离血红蛋白溶液：,,,4、透析,：（,如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）,,血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色,在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放,红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，,得到红色透明液体装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
二、实验操作：,样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定,,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,,透析过程动画演示,,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是,A 弄清各种蛋白质的空间结构,B 弄清各种蛋白质的功能,C 弄清各种蛋白质的合成过程,D 获得高纯度的蛋白质,,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是,A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质,B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质,C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质,D 二者根本无法比较,,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A 电荷的多少 B 分子的大小,C 肽链的多少 D 分子形状的差异,4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是,A 调节pH,B 维持红细胞的能量供应,C 防止微生物生长,D 防止血液凝固,,5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是,A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1,6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序,自上而下,是：,有,机溶剂-----,脂,类物质-----,血,红蛋白溶液,------,红,细胞破碎物沉淀,,（二）凝胶色谱操作---,纯化,1、凝胶色谱柱的制作：,,二、实验操作：,样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定,色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞,→安装色谱柱,,2、凝胶色谱柱的装填,步骤,操作要求,①,操作要求,色谱柱垂直固定在支架上,②,计算称量凝胶,根据色谱柱体积计算凝胶用量,③,配制悬浮液,凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀,凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴,④,装填悬浮液,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,⑤,缓冲液洗涤平衡,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,,装配好的凝胶柱,,3、样品加入与洗脱---,调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质,（1）调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
2）滴加透析样品：,吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝,胶面3）样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口4）洗脱：,小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱,5）收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,（6）,注意：,正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动注意：,正确的加样操作是,（1）,不要触及并破坏凝胶面2）贴壁加样3）使吸管管口沿管壁环绕移动3、样品加入与洗脱---,调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质,,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,,2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。
这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：,样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定,首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到,血红蛋白溶液,，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后,通过凝胶色谱法,将相对分子质量较大的,杂质蛋白除去,，即:样品的纯化；最后经,聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行纯度鉴定收集得到的纯化后的蛋白,,在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是,A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果,B、气泡阻碍蛋白质的运动,C、气泡与蛋白质发生化学反应,D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密,A,,样品的加入和洗脱的操作不正确的是,A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面,B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内,C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,A,,下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）,A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞,C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,,A,,三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度。
目的：,血,红,蛋,白,的,,取,和,分,离,,凝胶色谱法,原,理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组,成,作,用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗,分,离,纯,化,纯度鉴定,血,红,蛋,白,的,提,取,和,,离,蛋白质分子的差异性,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原,理,分离过程,凝胶电泳法,凝胶色谱法,原,理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组,成,作,用,缓冲溶液,组,成,作,用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗,分,离,纯,化,纯度鉴定,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗,分,离,纯,化,纯度鉴定,,,观察你处理的血液样品离心后,是否分层,（见教科书图5-18），,如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度四、实验结果分析与评价,,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。
此外，还可以加入大分子的有色物质，,例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，,观察色带移动的情况如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；,如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,四、实验结果分析与评价,本课题作业;,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?,2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?,3.电泳的作用及其原理是什么?,4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?,5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行,蛋白质的分离有什么意义?,,,,（1）计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量,（2）凝胶溶胀：,凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液,（3）,固定：,将色谱柱装置固定在支架上,（4）,装填：,将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
5）洗涤平衡：,装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的,磷酸缓冲液（pH为7.0）,充分洗涤平衡,12小时,装填时,注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,洗涤平衡时,注意：,1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象,2、凝胶色谱柱的装填,,4、用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法,,使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定蛋白质的分子量时，可选用一组,已知分子量的标准蛋白,同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的,电泳区带位置,，用,电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线,，可以测定,未知蛋白质,的分子量市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。