实验二十五 基因重组实验Ⅳ——重组体的筛选与鉴定 [原理] 限制性内切核酸酶酶切鉴定：具体原理见实验二十一PCR反应应鉴定：：具体原原理见实实验十八八[试剂]1、DNAA模板2、引物3、Ta DNNA聚合合酶4、dNTTPs（ddATPP、dGGTP、ddCTPP、dTTTP）5、10××PCRR 反应应缓冲液液：1000mmmol//L TTriss-HCCl ppH 88.3，5500mmmoll/L KCll，155mmool/LL MggCl22，0..1%明明胶6、矿物油油1、 超纯水8、EcooR II酶解反反应液（110×）: 1mool/LL pHH7.55 TTriss-HCCl ,, 0..5mool/LL NNaCll , 0..1mool/LL MMgCll2 9、Hinnd IIII酶酶解反应应液（110×）：1mmol//L ppH7..4 TTriss-HCCl ,, 1moll/L NaaCl , 0.007mool/LL MMgCll2 3.50××TAEE 电泳泳缓冲液液：称取取2422克Trris，加加入577.1mml冰乙乙酸，1100mml 00.5mmol//L EEDTAA，调节节pH至至8.00，加蒸蒸馏水至至10000mll。
10、.凝凝胶加样样缓冲液液：0..25%%溴酚蓝蓝、0..25%%二甲苯苯青FFF、400%蔗糖糖水溶液液（w//v）11、1%%（1..5%）琼琼脂糖凝凝胶：11×TAEE 1000mll含1gg（1.55g）琼琼脂糖[器材]1、DNAA扩增仪仪2、电泳仪仪、电泳泳槽3、微量移移液器4、紫外投投射仪5、0.55ml塑塑料离心心管6、样品槽槽模板（梳梳子）7、锥型瓶瓶（1000mll或500ml）8、一次性性塑料手手套9、凝胶成成像系统统[操作步骤骤]1. 酶酶切反应应体系的的建立（220μl反应应体系） 按下下表要求求配制酶酶切反应应体系质粒DNAA6μl10×Buuffeer2μlHindIIII1μlH2O10μlEcoR I1μl 混匀匀后置337℃水浴33h2. PPCR反反应体系系的制备备(255μl反应应体系))按下表要求求配制酶酶切反应应体系DNA2μl 10×Buuffeer2.5μlldNTP0.1μll H2O17.2μμlPrimeer-110.1μllTaqE1μlPrimeer-220.1μll50%甘油油2μl混匀后，220000rpmm离心330seec，然然后按 944℃ 5miin 944℃ 40ssec 555℃ 40ssec 335cyyclees 722℃ 90ssec 722℃ 3miin3. 电泳泳：1%%琼脂糖糖凝胶（酶酶切）和和1.55%琼脂脂糖凝胶胶（PCCR反应应）将20μll酶切和和PCRR产物进进行电泳泳，观察察结果。
Vocabbulaary in Bioocheemiccal tecchnoologgyAAbsorrbannce 吸光度Absorrbennt吸附剂Absorrptiion chrromaatoggrapphy吸附层析Absorrptiion speectrrum吸收光谱Acryllamiide,, Aaa/Accr丙烯酰胺（单单体）Adeniine,, A腺嘌呤Affinnityy chhrommatoograaphyy亲和层析Agaroose琼脂糖Agaroose gell ellecttropphorresiis，AAGE琼脂糖凝胶胶电泳Allelle sspeccifiic ooliggonuucleeotiide,, ASSO等位基因特特异性寡寡核苷酸酸杂交Ammonniumm peersuulfaate,, APP过硫酸胺Anglee rootorr角式转头Anionn exxchaangee chhrommatoograaphyy阴离子交换换层析CCarriier ampphollytee载体两性电电解质Catioon eexchhangge cchroomattogrraphhy阳离子交换换层析Celluulosse aacettatee meembrranee ellecttro -phhoreesiss，（CCAMEE）醋酸纤维薄薄膜电泳泳Celluulosse iion--excchanngerrs纤维素离子子交换剂剂Centrrifuuge离心机Centrrifuugall foorcee离心力Centrrifuugall teechnniquue离心技术Coenzzymee辅酶Colummn cchroomattogrraphhy柱层析Cytossinee, CC胞嘧啶DDenatturee grradiientt geel eelettro -phhoreesiss , DGGGE变性梯度凝凝胶电泳泳Deoxyyribbonuucleeic aciid, DNAA脱氧核糖核核酸Dialyysiss透析Diffeerenntiaal ccenttriffugaatioon差速离心Discoontiinuoous PAGGE不连续聚丙丙烯酰胺胺凝胶电电泳EEletrro-oosmoosiss电渗Emisssionn sppecttrumm发射光谱Excluusioon cchroomattogrraphhy排阻层析GGel cchroomattogrraphyy凝胶层析Gel ffilttrattionn凝胶过滤Guaniine，GG鸟嘌呤HHomoggeniizerr匀浆器Holozzymaase全酶IIon-eexchhangge cchroomattogrraphhy离子交换层层析Ion-eexchhangge ggel离子交换凝凝胶Ion-eexchhangge rresiin离子交换树树脂Isoellecttricc foocussingg, IIEF等电点聚焦焦Isoennzymme同工酶LLigannd配基MMeltiing temmperratuure,, Tmm溶解温度Matriix载体Mobille pphasse流动相Molecculaar ssievve ffilttrattionn分子筛过滤滤NN,N,NN’,NN’-meethyylennc Bisaccryllamiide , BissN,N,NN’,N’--四亚甲甲基 双双丙烯酰酰胺N,N,NN’,NN’-ttetrrameethyyletthylleneedi -amminee, TTEMEED四甲基乙二二胺OOsmossis渗透PPaperr chhrommatoograaphyy纸层析Partiitioon cchroomattogrraphhy分配层析Partiitioon ccoeffficciennt分配系数Photooeleectrric colloriimettry光电比色法法Plasmmid质粒Polyaacryylammidee geel eelecctroophooressis,, PAAGE聚丙烯酰胺胺凝胶Polymmeraase chaain reaactiion,, PCCR聚合酶链反反应Primeer引物RRelattivee ceentrrifuugall foorcee, RRCF相对离心力力Restrricttionn enndonnuclleasse ，RRE限制性内切切酶Restrricttionn frragmmentt leengtth ppolyymorrphiism,, RFFLP限制性片段段长度多多态性Rate zonnal cenntriifuggatiion速率区离心心法Reverrse osmmosiis反向渗透Revollutiion perr miinutte ,,rpmm每分钟转速速Ribonnuclleicc accid,, RNNA核糖核酸Rotorr转头SSaltiing in盐溶Saltiing outt盐析Saphaadex葡聚糖凝胶胶SDS-PPAGEESDS-聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶Sedimmenttatiion coeeffiicieent 沉降系数Sedimmenttatiion vellociity沉降速率Sedimmenttatiion timme,SST沉降时间Sephaarosse琼脂糖凝胶胶Sequeenciing测序Singlle sstraand connforrmattivee poolymmorpphissm, SSCCP单链构象多多态性Sodiuum ddodeecyll suulfaate,, SDDS十二烷基硫硫酸钠Specttropphottomeeterr分光光度计计Specttropphottomeeterry分光光度法法Statiionaary phaase固定相Swingg-ouut rrotoor水平式转头头TThin--layyer chrromaatoggrapphy,, TLLC薄层层析Transsmitttannce透光率Thymiine,, T胸腺嘧啶Transsforrmattionn转化Transsfecctioon转染Transsducctioon转导Transspossitiion转位UUltraafilltraatioon超滤Uraciil, U尿嘧啶VVisibble andd ulltraavioolett Sppecttro -phhotoometteryy紫外可见分分光光度度法Vectoor载体10。