血管内皮祖细胞对共同植入缺血再灌注模型大鼠脑内的神经干细胞增殖凋亡和血管形成的调节富奇志】，齐志国朱晓峰2,谢鹏 龙江佳木斯，佳木斯大学神经体400016重庆，重庆医科大学：第一附属医院神经内科1，神经科学中心3； 154002黑小五号宋体_的 研究血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）与神经干细胞（neuron stem cells, NSCs） 体对移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗带的神经干细胞增殖、凋亡和血管重建的影响方法线栓 灌注模型；血管内皮祖细胞、层粘连蛋白小1U标记的移入脑内神经干细胞和缺血半暗右间点Brdu标记的神经干细胞数NSCs+ePCs组明显高于NSCs组（P<0.05）； NSCs+EPCs组在各时 低于NSCs组（P<0.05）；各时间点NSCs+EPCs组血管新生数量明显多于EPCs组、缺血对照组和 NSCs组（P<0.05）结论血管内皮祖细胞可以促进移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗带的神经干细胞增殖，减少 其凋亡； 2 种细胞共移植可以促进缺血半暗带的血管新生［关键词］ 神经干细胞；毛细血管内皮祖细胞；缺血再灌注中图法分类号］ R322.81;R329.28;R743.31构建的 法建大鼠脑缺结果移 间点的凋亡率明显各时小五号黑体构建的移植复合体移入模型鼠脑缺血半暗带;免疫荧光双标观察神经干细胞的凋亡情况。
文献标识码］ AEndothelial progenitor cells combined impl suppresses apoptosis of neural stem cells and angiogenesis of MCAO/R ratsQon黑mprov^ proKferatbn andFu Qizhii, Qi Zhiguo1, Zhu Xiaofeng2；Xiiversity, Chongqing, 400016;2Neuroscience Center, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang Province, 154002, China)1Department of Neurology, First Affiliated Hospital, 3Neuroscience Center, ChongqingiCal小bstract] Objective < TQainme s字体ate the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) which complexed ith neuron stem cells (NSCs) after transplanted into ischemia and reperfusion (I/R) rat model on the proliferation and apoptosis of the NSCs and vasal construction. Methods Totally 150 SD adult male rats were randomly and equally divided into 5 groups, sham operation group, I/R group, I/R+NSCs group, I/R+EPCs group, and I/R+NSCs+EPC* group. The rats were further divided into 5 subgroups according to the time points of 3, 7, 14, 30 and以小五号缩进左右各ra1个plantation. I/R reversiblyligating middle cerebral arter英文提卑内容5 号字体s were born in 24 h and identified with Nestinl staining. EPCs were obtained from the artery blood of SD rats and verified with immunocytochemical stainings of CD31, CD34 and KDR after culture. The complex of NSCs and EPCs was produced with aid of laminin. Then the complex were transplanted into the ischemia penumbra of corresponding model rat brain. The proliferation and apoptosis of NSCs, and the fomation of new vessels were observed through immunohistochemistry and double -labeled immunofluorescence staining. Results The proliferation of NSCs was increased, apoptosis cells were decreased and the new vessels were raised in the complex transplantation when compared with single NSCs or EPCs transplantation groups. Conclusion The complex of NSCs and EPCs transplantation improves the proliferation of NSCs, suppresses cell apoptosis and promotes the formation of new vessels.[Key words] neural stem cells; endothelial progenitor cells; ischemic and reperfusionrat model was established by derived from the hippocampus of SD rats加粗Supy the National Basic Research Program (973 Program, 2009CB008300). Corresponding author： XieT^ng, Tel: 86-23-68485490, E-mail: xiepeng58@小六号黑号［基金项目］国家重点基础研究发展计划（973计划小六号9宋*体83 通信作者］谢鹏，：（023）68485490，E-mlil: xie；e'ng58@00)小al stem cells.家级动物标准），后血后神经干细胞移植组移植组（EPCs组）、缺血神经干细胞加血管内皮祖细胞移植 组（NSCs+EPCs组），各组又根据移植后不同时间点分为3、7、 14、 30、 60 d 5个亚组，每个时间点6只。
1.2 药品及试剂缺血性脑血管病是人类脑血管疾病中高致死致 残率的疾病之一缺血性脑血管病包括两大病理损 害，即神经元的缺损和局部血循环结构的破坏近 年来，神经再生和神经干细胞（neur NSCs）的发现为干细胞移植疗法修复脑梗死病灶提 供了依据⑴但NSCs移植后宋体活率和神经元转化率 低严重制约了 NSCs移植在临床上的应用［2］1997 年，血管内皮祖细胞 （endothelial progenitor cells, EPCs）分离培养成功，并发现可以移植EPCs可以促 进血管重建研究发现，成人海马与脉管系统相连 的稠密丛中存在正在分裂的细胞，表明神经再生的 发生在血管生成的环境中，脑内血管再生和神经再 生有紧密联系本实验研究血管内皮祖细胞和神经 干细胞中间填充神经间黏附因子形成微细胞团移入 缺血再灌注大鼠缺血半暗带，观察神经干细胞的增 殖和凋亡情况及缺血半暗区血管形成情况，为二者 联合移植治疗缺血性脑血管病提供实验依据1.1 主要试1材料与方法五 号黑体,2倍行距成年雄性 SD 大鼠 150 只，实验动物包括两组第一组新 生24 h内SD大鼠60只和雄性SD大鼠20只（用于NSCs、 EPCs原代细胞培养）成年雄性SD大鼠培养,以上动物均（由 重庆医科大学实验动物中心提供,符合国 者体质量250〜350 g,随机分为假栏术组、缺血对照组、缺 （NSCs组）、缺血后血管内皮祖细胞M-199培养基、胎牛血清、纤维连接蛋白（FN）、VEGF、 bFGF、兔抗大鼠CD31单克隆抗体、兔抗大鼠CD34单克隆 抗体、兔抗大鼠 KDR 单克隆抗体、羊抗兔（二抗）免疫组化染 色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒（以上购自美国Sigma公司）； 5 溴脱氧尿苷（BrdU）、小鼠抗巢蛋白（Nestin）单克隆抗 体、表皮生长因子（EGF）、兔抗大鼠VEGF单克隆抗体、 小鼠抗大鼠caspase IgG、小鼠抗大鼠Brdu IgG单克隆抗体、 抗小鼠免疫组化试剂盒（购自晶美生物工程公司）；层粘连蛋 白（LN）（购自美国Invitrogen公司）；DMEM/F12干粉培养 基（购自美国Gibico BRL公司）、SABC CY3试剂盒、B27（购 自美国Boster公司）。
1.3 大鼠神经干细胞的培养及鉴定在无菌条件，取新生24 h内SD大鼠的海马组织，剪碎 后反复吹打，200目细胞筛网过滤后，离心5 min，弃上清， 加入完全神经干细胞培养液DMEMF12, 2%B27, 20 p g/L, EGF） 1 ml,用吸管轻轻吹打成细胞悬液，调整细胞密度为 5X108/L，加入25 cm培养瓶中，放入适量完全培养液，在 37 °C、体积分数为0.05的CO2条件静置培养7 d,每隔2天换 液1次,7 d后传代，传3代后备用采用免疫组织化学法Nestin 染色鉴定神经干细胞1.4 EPCs 的体外分离、培养和鉴定参照Wang等⑶方法，抽取SD大鼠动脉血10〜15 ml,室温下 400 r/min离心30 min,吸出第2层的单核细胞层，然后用PBS 清洗，细胞吹打成悬液后计数，将单核细胞以（1〜3）X105的密 度，分别接种于铺有 FN 的塑料培养皿中，加入培养液，放入 37 C, 5%CO2，湿度100%细胞培养箱，每4天换液1次对 培养的第4、7、10、14天的细胞，用甲醇固定2次，每次20 min， 胎牛血清工作液封闭非特异性抗原30 min,分别加入鼠抗人 CD31、CD34及兔抗人KDR单克隆抗体（1 ： 50）, 37 C孵育 2 h，滴加生物素标记二抗，37 C孵育20 min，滴加辣根酶标 记链酶卵白素工作液， DAB 显色。
封片后上镜观察1.5 EPCs和NSCs共移植复合体构建将传代的EPCs用2.5 g/L胰酶消化20 min,轻轻吹打成单 细胞，以3X107/L的密度接种在培养瓶中，12 h贴壁后吸出 EPCs 培养液，涂以一层细胞外基质（层粘连蛋白）后接种经 1.25 g/L胰酶消化20 min后吹打成单细胞的NSCs （以Brdu标 记），密度为6X108/L，加入NSCs完全培养液培养3〜6 h, 经镜下观察NSCs完全贴壁后吸出培养液，涂以一薄层细胞外 基质，再接种以上相同密度的EPCs,加入神经干细胞完全培养 液70 ml培养瓶分别接种两种细胞4 ml,共培养12〜24 h, 镜下观察最后接种的 EPCs 贴壁，并由消化后的圆形变为椭圆 或不规形用细胞刮刀将细胞从瓶壁上依次刮起，适力吹打成 1〜3个EPCs与5〜18个NSCs相互包绕的细胞团，用150目 细胞筛网过滤，取滤液再用500目细胞筛网过滤，取筛网上细 胞团即为共移植复合体然后用免疫荧光方法进行鉴定1.6 大脑中动脉缺血/ 再灌注动物模型的制备除假手术组外，各组均采用Longa等［4］线栓法建立局灶性 脑缺血再灌注动物模型手术结束麻醉清醒后，神经缺损评分 标准观察大鼠神经症状，选择行走时身体向偏瘫侧转圈作为移 植对象。
假手术组只麻醉，颈部皮肤切口，即缝合、不作其他 处理1.7 EPCs、NSCs及共移植复合体的移植体溶解于磷酸盐缓冲液中，细胞浓度调整为 2X1010/L EPCs 组、 NSCs 组和 NSCs+EPCs 组分别移植 3 种细胞悬液 10 p l在立体定位仪下，经微量注射器进行移植，移植速度为 0.5 p l/min,在缺血侧缺血半暗带区（前囟后0.5 mm,矢状缝右 旁开3.5 mm）,垂直进针，在进针5.0 min后缓慢推入细胞悬液， 留针 10 min 后缓慢拔针1.8 神经干细胞增殖和凋亡的检测Brdu阳性细胞免疫组化检测：切片常规脱蜡至水，微波修 复，加入小鼠抗大鼠Brdu 一抗（1 ： 100） 4 C过夜，PBS冲 洗；生物素化山羊抗小鼠IgG 25 C孵育，PBS冲洗，DAB显 色，复染，镜下计数Brdu阳性细胞数免疫荧光双标染色：石蜡切片，按常规下行入水，加 Brdu（1 : 100）抗体与 Caspase 3（1： 200）的组合抗体，4 °C 过夜，以含0.1% Triton X-100的PBS冲洗3次，加入CY3 和 FITC 的二抗（CY3 标记Brdu, FITC 标记 Caspase-3）, 37 C 孵育45 min， 0.05 mol碳酸缓冲液甘油圭寸固。
荧光显微镜下 拍照，计数阳性细胞数显微镜高倍视野（X400）下，在缺血 侧皮质随机选取5个不重复视野统计阳性细胞的平均数 凋亡率=NSCs双阳性荧光细胞/Brdu阳性荧光细胞X100% 1.10 统计学分析采用SPSS 10.0软件进行统计处理，数据以土s表示，组 间比较行方差分析及q检验2 结果2.1 EPCs、NSCs 和共移植复合体镜下所见及鉴定结果海马NSCs原代分离后在12 h内单NSC相互聚集成云 雾状，4d时即可见大量细胞球，由几十个到上百个悬浮生长 的圆球形细胞组成，相差镜下该细胞球立体感强，周边光滑， 但球中央可见细胞碎片掺杂经传代后杂质减少以至消失， 克隆后经Nestin免疫荧光鉴定，阳性细胞球呈细胞新鲜分 离的外周血单核细胞呈圆形，体积小浮在培养液中3〜4 d 可见细胞开始增大贴壁，细胞数增加，细胞呈梭形；7~10 d 出现多个细胞团并呈典型线样排列培养第 4、7、10 天时 EPCs CD31、CD34及KDR免疫组化染色细胞呈阳性，10〜 14 d细胞免疫荧光染色CD31、CD34及KDR表达在95%以 上显微镜下可见共移植体细胞团不规则，NSCs被EPCs包 绕或相互粘贴，平均每个共移植体复合细胞数8〜15个，其 中EPCs平均2.8个。
免疫荧光可见红色EPCs包被绿色NSCs， 或相互粘贴（图1）2.2 NSCs 增殖情况3 讨论一般单张照片高为5 cm, 两张排单栏，多张图片, 看版而排（可排通栏）图 1 免疫荧光观察神经干细胞和血管植复合体 （荧光显微镜x200）假手术组、缺血对照组和EPCs组各时间点未见Brdu阳性 细胞；NSCs组和NSCs+EPCs组3、7 d Brdu阳性细胞主要集 中在针迹部位；14 d Brdu阳性细胞数最多，散在分布，部分与 周围组织整合； 30、 60 d 阳性细胞数有所下降，细胞与周围组 织充分整合；各时间点Brdu阳性细胞数NSCs+EPCs组明显高 于 NSCs 组（P<0.05）（表 1、图 2）表1 NSCs组和NSCs+EPCs组移植后不同时间点神经干细胞的增殖数比较 （个，n=6, x 士s）3 d 7 d 14 d _表格内容：一般为三线表NSCs 组 20.£6±3.58 28.74±3.25 39.28±5.5 2小六号，宋体38.64±4.33b 45.38±4.97a 5&32±6•曲a ^05|6±5.42a组别30 d60 d22.65±3.78 10.25±2.63NSCs+EPCs 组19.35±1.68ba: P<0.05, b: P<0.01，与 图表较释：六号，楷休分泌的一些因子中，如胰岛素样生长因子、血管内 皮生长因子等能促进神经干细胞的增殖抑制其凋亡 ［8,9］。
层黏连蛋白是一种神经细胞外基质，其对神经而引发了相关基因表 脑血管疾病的应用受神经干细胞的移植在缺血性脑血管疾病治疗中 的作用已经明确，但植入缺血区的神经干细胞分发 生依赖于 bax 基因启动的凋亡和“失巢”凋亡其 原因单纯将神经干细胞植入缺血半暗区，神经干细 胞不具备足够的神经因子分泌能力使细胞营养供应 不足和细胞间号调节中断 达这使神经干细胞在缺血性 到限制的主要因素Asahara等⑸首次从人外周血中 分离EPCs,并可分化为成熟内皮细胞的特殊血细 胞，具有归巢能力、分泌功能和参与出生后血管再 生等特性Rehman等⑹研究发现EPCs能够分泌多 种细胞因子，如血管内皮生长因子、粒细胞克隆刺 激因子、粒巨细胞克隆刺激因子等其分化成熟后 也可以分泌一些可溶性细胞因子，如胰岛素样生长 因子（insulin like gowth factor 1，IGF-1）、白细胞 干扰素、血小板衍生生长因子、转化生长因子、粒 细胞克隆刺激因子等⑺在EPCs及其分化成熟细胞 干细胞有保护作用减少其凋亡，还模拟类神经生长 因子的营养神经的作用，促进神经干细胞增殖，并 通过模拟体内环境解决失巢凋亡的发生［10］。
本实验 结果显示，在早期将EPCs、层粘连蛋白和NSCs复 合体移入大鼠缺血半暗带后，神经干细胞增殖较单 纯神经干细胞移植增多且凋亡减少，这与EPCs的旁 分泌和其与层黏连蛋白共同构成神经干细胞生存的 微环境有关后期由于移入的内皮祖细胞加快了脑 缺血区血管重建的发生，进一步改善了移入脑内神 经干细胞的生存条件本实验也发现在复合体移植1 个月后脑缺血半暗区仍有移入的神经干细胞增生， 且凋亡细胞明显少于单纯神经干细胞移植组血管新生和神经再生是通过相同的因子进行调 控协同和信号的相互联系，这些因子主要括包括碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 （basic fibroblast growthfactor，bFGF）、血管内皮生长因子、IGF-1和 转化生长因子Q等，内皮细胞分泌的已知可作用于(编辑 张 维)[1]Tan P.mechanismCurr Neurovasc Res, 2006, 3(1): 67-72[2]Toda H, Takahashi J,wakami N, et al. Grafting neural stem cells[3]improved the impaired spatial recognition in6号宋体ischemic rats[J]. NeurosciLett, 2001, 316(1): 9-12 1王肃生, 冀航, 梁刚, 等. 鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导神经元的有丝分裂原和分化存活的因子有 bFGF、 IGF-1、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子和 脑源性生长因子(brain derived neurotrophicf-actor, BDNF)。
在血管新生中产生的神经因子对神经干细 胞保护作用的同时,神经干细胞分泌的因子如 BDNF、胶质源性生长因子和神经因子等［11,12】也可 以促进新生血管的形成本实验发现EPCs、层黏连 蛋白和神经干细胞复合体移入缺血半暗带后血管新 生的度明显高于单纯EPCs移植这也说明血管新生 和神经发生具有协同作用参考文献：悬进缩进背与首行文字对齐)physiopathology and分化［J］.中国美容整形外科杂志2007, 3(18): 237-239.[4]Longa E Z, Weinstein P R, Carilson S, et al. Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.[5] Asahara T, Masuda H, et al. Bone marrow qrigin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization[J]. Circ Res, 1999, 85: 221-228.[6] Rehman J, Li J, Orschell C M, et al．Peripheral blood “endothelial progenitor cells” are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors[J]. Circulation, 2003, 107(8)： 1164-1169.[7] Kucknoor A S, Mundodi V, Alderete J F．The proteins secreted by Trichomonas vaginalis and vaginal epithelial cell response to secreted and episomally expressed AP65[J]. Cell Microbiol, 2007, 9(11): 2586-2597.[8] Ayuso S A, Moliterno J A, Kratovac S, et al．Activated EGFR signaling increases proliferation, survival, and migration and blocks neuronal differentiation in post natal neural stem cells[J]. J Neurooncol, 2009, 95(24): 2417-2422.[9] Zhou X M, Yuan H P, Wu D L, et al．Study of brain derived neurotrophic factor gene transgenic neural stem cells in the rat retina[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(14): 1642-1649.[10] Zhan M, Zhao H, Han Z C. Signalling mechanisms of anoikis[J]. HistolHistopathol , 2004, 19(3)： 973-983.[11] Niles L P, Armstrong K J, Rincon Castro L M, et al. Neural stem cells express melatonin receptors and neurotrophic factors: colocalization of the MT1 receptor with neuronal and glial markers[J]. BMC Neurosci,2004, 5(1): 41．［12］王岩峰, 吕刚, 李雷, 等. 神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后胶质细 胞源性神经营养因子与生长相关蛋白43基因表达的影响［J］.中国修 复重建外科杂志2005><9(6)： 416-419.六号，黑体 / (收稿：2009-09-26；修回：2009-10-20)五号，楷体。