胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭 2016.7.21目录前言 21分离制备PMSC组织的选取 32脐带，胎盘MSC的分离与纯化 52.1胎盘组织的获取，存储与清洗 52-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 63 原代培养和继代培养 103-1培养基 103-2培养密度 113-3培养条件 113-4换液 113-5 传代培养 123-6细胞形态与生长速度 123-7 MSC的冻存与复苏： 124细胞表面抗原检测 135生长曲线 136细胞周期 137分化潜能 13参考文献 13附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 15脐带血 15脐带 15羊膜 17绒毛膜 18蜕膜层 18胎盘 19整体灌注法 20附件2 背景知识 20附件3 PMSC实验所需试剂 21前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来MSC是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等MSC具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达，是基因治疗中重要的载体细胞此外，一些研究学者还发现，MSC具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应所以，MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。
近年来MSC已逐步成为干细胞研究的热点（张慧娟等，2014） 目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得虽然分离方法简便，但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每105-106个单个核细胞中大约只有1个；而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞，然而，从这些组织中获得的细胞数量较为有限以上因素，都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用目前胎盘或脐带属于临床废弃物，容易获得，并且无污染，取材研究和应用基本无伦理学争议，研究表明胎盘或脐带含有丰富的MSC有研究表明PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养，细胞活性更好，还可诱导分化成脂肪，成骨等多种细胞并且这些胎盘源的间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有极低的免疫原性，大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然的免疫耐受，因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人-动物模型间的异种间移植，由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小，这对于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。
目前MSC主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应动物模型研究结果表明PMSC对子宫内膜损伤（刘芳，2013），大鼠肝组织损伤（宫黎明等，2011），APP+转基因鼠阿尔茨海默病（郭亚男等，2009）均有疗效，也可以用于构建组织工程皮肤（徐彪等，2013）所以，综合充分利用胎盘和脐带作为间充质干细胞新来源，优化分离纯化以及传代培养条件，加快细胞繁殖速度，降低培养成本以高效率获取大量的PMSC对于的各种疾病实验研究及医院各个科室的临床应用，都具有重要意义1分离制备PMSC组织的选取胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，人足月娩出的胎盘由羊膜层、绒毛膜层和蜕膜层组成从脐带血（于海微等，2009；管英华等，2011），脐带（徐燕等，2009；韩之波等，2012；管英华等，2011；李艳琪等，2014；赵琳等，2016），整个胎盘（陆琰等，2009；沙文琼等，2010；刘洋等，2015；赖平等，2016），胎盘的羊膜层（宫黎明等，2011；徐彪等，2013；张慧娟等，2014；丛姗等，2015），绒毛膜层（洪艳等，2014；韩之波等，2012）和蜕膜层（韩之波等，2013）分离培养MSC均有报道目前大多数研究者取胎盘小叶（包括绒毛层和绒毛滋养层）进行分离（洪艳等，2014）。
胎盘的细胞成分较复杂，既有滋养细胞，也有间质细胞、血管内皮细胞和Hofbauer细胞（沙文琼等，2010）由胎盘组织分离制备MSC时不可避免会有其它细胞的干扰（苗宗宁等，2009），其中以数量最多的血细胞干扰为主分离MSC选取组织时需要考虑哪个部位的组织可能含有最多的MSC，并且尽可能降低其它种类细胞的干扰，以获得纯度高，活力强的MSC对于人脐带血来源的MSC（human umbilical cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否稳定传代扩增，曾有一定争议，后来的实验结果证实脐带血中存在MSC，并表明脐带血来源MSC与骨髓来源MSC具有相同的生物学特性及功能特征（于海微等，2009）但是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞，分离间充质干细胞的过程以丢失造血干细胞为代价，而且个体差异大（徐燕等，2009）脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’s Jelly，外层由羊膜来源的上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路（管英华等，2011）不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC（human umbilical cord MSC, hUC-MSC）已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源（徐燕等，2009），故制备hUC-MSC一般剥离脐带动静脉和外层上皮。
管英华等（2011）比较了脐血和脐带两种来源的MSC原代培养过程，结果表明脐血中细胞成分复杂，原代培养多见成纤维样和大圆形破骨样两种形态的贴壁细胞，随着换液和传代破骨样细胞逐渐减少和消失，剩下形态较为单一的呈漩涡样的细胞集落; 脐带来源培养的贴壁细胞不会随换液丢失，且细胞形态以成纤维样细胞为主，种类单一hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培养的时间短，培养成功率明显增高羊膜是胎膜最内层，胎盘包裹胎儿面的一层薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁发育而成，在胎盘面与绒毛膜相贴，由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织人羊膜间充质细胞来源于原条期的胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层越来越多的研究已证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymal cells, hAD-MSCs）不但表达成体干细胞特性中的间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性，相关研究表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2和NANOG（张惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性标志（宫黎明等，2011），近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下，可分化成来自3个胚层的所有细胞（宫黎明等，2011）。
有研究比较人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力，发现培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞（徐彪等，2013）洪艳等（2014）分别从绒毛膜和绒毛滋养层分离并培养MSC，发现在分离过程中，从绒毛膜和绒毛滋养层得到的细胞量都很多，绒毛滋养层的细胞量甚至会超越绒毛膜的细胞量但是在接种后培养时，由于绒毛滋养层血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的贴壁，无法贴壁就无法继续生长，由此导致后期细胞生长慢，收获细胞少韩之波等（2013）的研究表明来自母体的底蜕膜组织也可以分离制备MSC苗宗宁等（2009）将胎盘组织分为3 组，分别是中央带组即脐带附着处，边缘带组即距脐带附着点最远处和中间带组即两者之间中点处分别全层连续切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分别做免疫荧光和免疫组织化学染色，显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域，结果表明中间层的阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层和底板层；同为中间层，中央带较中间带及边缘带表达更强由此推测，在接近血管丰富的脐带附着部的胎盘中间层取材易于获得较丰富的PMSCs2脐带，胎盘MSC的分离与纯化2.1胎盘组织的获取，存储与清洗母血检测 HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。
产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病临床足月正常剖宫产后胎盘，大小及质量在正常范围内，胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位经与产妇及其家属签署知情同意书，实验方案经并经医院伦理委员会批准在产房无菌条件下获取脐带，胎盘文献报道中取组织后有如下处理方法：立即浸入胎盘储存袋（加拿大LABPLAS公司的无菌采样袋，含99%低糖DMEM，1%双抗即青链霉素的组织保护液），在48 h内转移至实验室脐带静置于４℃冰箱12h， 观察保存脐带的PBS液， 若无浑浊说明无感染脐带采集后在6 h内进行处理，切除双侧带夹痕及淤血的部分无菌采集健康足月剖宫产羊膜，冰盒中2 h内运达实验室进入试验流程无菌采集健康足月剖宫产胎盘，并立即进入分离提取程序文献报道中组织块的用量及获得：胎盘组织约 50 g3~5个胎盘小叶剪取胎儿侧的绒毛膜层组织10 mL眼科手术剪将组织剪碎（细碎小块；1mm3大小；呈肉糜状，以能用吸管吸取为标准；约3mm；5 mm3大小的碎块）组织绞碎分离机（近似肉糜）文献中的组织浸泡液/清洗液：# 生理盐水# D-Hank’s平衡液# 磷酸缓冲液（PBS）# 杜氏磷酸缓冲液（D-PBS）# 含肝素的PBS# 含有双抗生素的PBS (0.1%的青链霉素，1%的青链霉素, 100 U/mL青霉素, 100 µg/mL链霉素)# 含有青霉素和链霉素的无血清 DMEM /F12 培养基2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法已报道脐带，胎盘MSC的分离方法有组织块贴壁法，酶消化法以及整体灌注法。
组织贴壁培养法得到的细胞纯度较高，对细胞伤害小，操作相对简单，将组织块剪碎、贴壁后加培养基培养即可，但原代培养所需周期较长、获得细胞数量相对有限李艳琪等（2014）在首次组织块贴壁培养获得MSC后，将组织块转移到新的培瓶中继续培养，两三天后仍可见到贴壁细胞，第5 天可形成明显的细胞克隆这种改进的组织块二次贴壁方法可在较短时间内获得大量原代细胞 酶消化法可直接将消化得到原代细胞，但是获得的细胞纯度略低、状态不均一，由于消化时间不易掌握，消化时间过短不能得到足量细胞，消化时间过长会对细胞造成伤害，损伤细胞膜成分，导致无法贴壁生长，影响细胞的成活率和增殖能力，甚至导致细胞死亡，给后续培养带来困难（李艳琪等，2014）；对于某些组织如脐带Wharton’s胶经酶消化后的胶体黏稠，不易离心徐燕等2009比较，植块法培养 6~10 d 可见成纤维样细胞从植块边缘爬出，在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上明显好于胶原酶消化法（1 g/L胶原酶Ⅱ3.0~5.0 mL， 置于含双抗的PBS中，37 ℃孵育0.5 h）比较存在差异；而胶原酶与胰酶联合消化法（1 g/L胶原酶Ⅱ于37 ℃孵育16 h，以PBS洗涤后加入25 g/L胰酶于37 ℃孵育0.5 h）接种后未见明显贴壁细胞。
常用的酶包括胰蛋白酶，胶原蛋白酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ胰蛋白酶消化能力强，Ⅱ型胶原酶消化能力相对较弱，但对细胞膜损害较小很多研究者对酶的浓度，消化时间，消化方式，多种消化酶联合消化做了大量探索寻求既能充分的分离细胞，又能避免细胞的损伤的方法（赖平等，2016）组织经酶消化后需要用筛网/多层纱布过滤（100目，200目，300目，100 µm的滤器），除去未被消化的大组织块滤出的细胞成分复杂，常含有大量的血细胞现阶段用于分离纯化方法间充质干细胞的方法主要有以下几种：一般离心、密度梯度离心法、贴壁筛选法、红细胞裂解液法、淋巴细胞分离液( Ficoll) 、羟乙基淀粉沉淀、流式细胞仪分选法或磁珠分选法因为间充质干细胞没有特异的表面标志，应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法会损失大量细胞，且成本高每种方法各有优缺点，使用红细胞裂解液对于间充质干细胞的损伤大，使用淋巴细胞分离液进行分离的可重复性较差，技术不稳定（洪艳等，2014）文献中报道的消化酶的浓度，消化时间，次数及组合消化：机械剥离胎盘羊膜组织，PBS反复冲洗，将羊膜组织剪成细碎小块，0.25%胰酶37 ℃消化10 min，过100目筛网过滤获得细胞液经胰酶消化后的组织块，继续经0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化15 min。
含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM终止反应后，过100目筛网获得细胞液两次收集的细胞液1 000 r/min离心10 min，弃上清液（徐彪等，2013）将胎盘组织碎片置于200 mL无菌离心管中，联合应用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶消化胎盘组织碎片37 ℃摇床消化30 min，去除组织留取消化液，经1 500 r/min离心5 min，收集离心获得的细胞沉淀将离心后收集到的细胞重悬于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基（刘洋等，2015）剪碎羊膜，加入0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na消化液，37℃，200 r/min旋转消化10 min，弃上清，再加入消化液， 37℃ 旋转消化30 min，弃上清，按同样的程序再重复消化2次经胰酶消化后剩余的组织用D-PBS液冲洗，加入0.75 g/L Ⅱ型胶原酶-0.075 g/L DNase I消化液， 37 ℃、200 r/min旋转消化2.0~3.0 h，直至组织完全消化，经300目 不锈钢网过滤， 收集细胞滤液，1 500 r/min，离心10 min，弃上清，细胞沉淀悬浮于LG-DMEM培养基（宫黎明等，2011）。
张慧娟等（2014）无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，分别通过7 种消化方法，发现用 0.05 g/L 的胰蛋白酶连续消化 2 次每次消化 30 min，然后用 1 g/L 的胶原酶消化 60 min 是最合适的人羊膜间充质干细胞体外分离培养条件0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min0.75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min0.05 g/L胰蛋白酶与0.75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min0.05 g/L的胰酶消化30 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min0.05 g/L的胰蛋白酶连续两次消化30 min后，再加入0.75 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min0.05 g/L的胰酶连续2次消化40 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min0.05 g/L的胰酶连续2次消化30 min后，再加1 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min取前处理的样品在37 ℃下，用0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min，用含体积分数5%的胎牛血清DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，筛中组织经PBS冲洗后装入培养皿中，然后加入1 g/L的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃下消化60 min，之后用含体积分数5%的胎牛血清DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，滤液在1 500 r/min的离心机中离心5 min，去上清液，换DMEM/F12培养基混悬细胞并接种于培养皿中（张慧娟等，2014）。
用眼科手术剪将羊膜剪碎约1 mm×1 mm组织块，加入等体积的0.05% trypsin-EDTA， 37 ℃水浴震荡消化30 min 后加入含血清的培养液， 离心去上清， 如此反复消化两次， 再用PBS洗2~3次， 尽可能去除上皮细胞用细胞筛过滤后剩余的羊膜组织加入不同浓度Ⅰ型胶原酶(0.75、1.00和2.00 mg/mL)，37 ℃水浴震荡消化60 min， 加入含血清的培养液终止消化， 混匀后用200 目细胞筛过滤， 再将滤液1 500 r/min 离心 5 min 收集细胞（丛珊等，2015）按体积比约 1∶6 加入Ⅱ型胶原酶( 0.1% ) ， 置于 37 ℃恒温水浴箱中消化30 min， 间隔 5 min 适当混匀组织与消化液之后纱布过滤，上淋巴细胞分离液（赖平等，2016）使用pH 7.4、含25 mmol/LHEPES的D-Hank’s作为消化缓冲液，加入终浓度为2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNaseⅠ组成消化液，冲洗后的胎盘组织分阶段消化，每个阶段在恒温气浴摇床中37 ℃、180 r/min消化20 min（沙文琼等，2010）用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约5 mm3大小的碎块Ⅱ型胶原酶10 mL （酶消化终浓度0.1%），置于摇床内37 ℃、250 r/min振荡，约90 min后终止消化（洪艳等，2014）。
文献中报道的纯化方法：将细胞悬液缓慢加至已配好的淋巴细胞分离液中1 500 r · min-1， 4℃离心20 min，离心后可见“白膜层”，小心吸取该区域细胞，并加入 4 倍于该体积的 PBS 稀释，1000 r·min-1，常温下离心 5 min重复一次，弃上清（赖平等，2016）Percoll梯度密度分离： 在50 mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5 mL再缓缓加入5 mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1 200 g离心20 min 小心弃除离心管20 mL刻度以上的液体，收集12.5~20.0 mL刻度的细胞层(滋养细胞)和12.5~7.5 mL刻度(胎盘间充质干细胞)的液体，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1 000 g离心15 min（沙文琼等，2010）陆琰等（2009）比较了四种胎盘组织分离纯化从MSC的方法：胶原酶Ⅳ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+ 氯化铵裂解红细胞组与胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组比较，其余3 组获取的细胞数均明显减少（t =2.92~8.16，P < 0.05）。
在其他条件相同的情况下，胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为100%，其余3 组分别为80%，80%，20%剪碎的胎盘组织与1 g/L胶原酶Ⅱ中， 37 ℃消化45 min然后过细胞筛网，收集各组细胞悬液，分别于室温以1 000 r/min离心5 min，弃上清用PBS重悬细胞，加入60 g/L羟乙基淀粉（体积比为4:1）充分混匀，室温静置45 min，小心吸取上清，1 000 r/min离心5 min，弃上清， PBS洗涤2次以完全培养基重悬，制成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数活细胞数按1.5×109 L-1密度接种于T-25塑料培养瓶中（陆琰等，2009）3 原代培养和继代培养3-1培养基从文献报道可以看出，需要10%胎牛血清，低糖的DMEM/F12完全培养基，100 U/mL青霉素+100 µg/mL链霉素，此外可选的有5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，10 μg/L表皮生长因子，10 µg/L血小板衍生生长因子文献中报道的培养基：# 10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基# 5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10 μg/L表皮生长因子的L-DMEM完全培养基#10%胎牛血清的α-MEM培养基# LG-DMEM培养基(含体积分数为10%的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55 μmol/L 2-巯基乙醇、1 mmol/L丙酮酸钠、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素)# DMEM/ F12+10% FBS+10 ng/mL bFGF+100 U/mL青霉素+100 µg/mL链霉素# 10%的胎牛血清的低糖DMEM# 含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12 # 含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基# 完全培养基(含体积分数为2%胎牛血清、40% MCDB201、10 µg/L血小板衍生生长因子、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、10 µg/L表皮生长因子的DF12培养基)# DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1% enicillin-Streptomycin+5 µg/L碱性成纤维细胞生长因子3-2培养密度原代培养的细胞接种密度可能对成功培养有影响，于海微等（2009）试验了5×108 L-1、 1×109 L-1、 5×109 L-1、 1×1010 L-1的接种密度，发现以5×108 L-1密度接种时细胞一直无法传代，以5×109 L-1的密度接种时细胞贴壁时间、出现伸展时间及原代培养时间均显著短于其他接种密度。
文献中报道的接种密度：2.2×108 L-11.5×109 L-11×106/cm21×108 L-13×106/皿， 接种若干Ø100 mm细胞培养皿3-3培养条件37 ℃、饱和湿度、体积分数为5% CO2孵育箱内培养3-4换液细胞生长消耗培养基的养分，同时产生代谢废物，限制细胞生长，所以需要及时换液，但是换液太频繁会造成浪费，此外可以胎盘间充质干细胞呈贴壁生长，可以利用此特性在换液时与其他杂细胞进一步分离，但在培养早期，胎盘间充质干细胞贴壁不牢固，第一次换液时间过早将损失获取的胎盘间充质干细胞故需要通过实时观察并根据实际情况探究合适的原代培养的第一次换液时间和后续培养的换液频率文献中报道的首次换液时间有2d，3d，7d全量或半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每三四天换液1次文献中报道的换液时间和方式：每3 d全量换液1次培养48 h后半量换液，去除未贴壁细胞，以后每三四天换液1次7 d后首次全量换液，弃去未贴壁细胞，每三四天换液1次3 d后半量换液，1周后再次换液，此后每隔3 d换液1次5~7 d后全量换液，以后每3 d换液3d全量换液，以后每周换液2次3d后半量换液，继续培养2d后全量换液2d换液，以后每3 d换液1次3-5 传代培养待原代培养的细胞贴壁连生面积达70%~90%后（贴壁细胞生长至 70% -90%融合时），用胰酶消化（2.5 g/L胰酶或0.25%胰酶或1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸），按1：2或1：3或1∶4的比例传代，或以（2.5~5.0）×103/cm2密度接种传代培养。
消化时间？去除培养基后加酶消化？胰蛋白酶用PBS还是培养基溶解？每个培养瓶用多少量的酶消化？）3-6细胞形态与生长速度3-7 MSC的冻存与复苏：冻存液中DMSO的浓度可能对细胞活力产生影响，丛珊等（2015）对此进行过实验，将 3 组不同冻存液冻存的 hAMSCs 冻存 48 h后进行复苏培养冷冻保护液一： 5% 二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)＋50% 标准胎牛血清+45% DMEM/F12冷冻保护液二：10% DMSO＋50% 标准胎牛血清+40% DMEM/F12冷冻保护液三：20% DMSO＋50% 标准胎牛血清+30% DMEM/F12结果显示， DMSO浓度为5%时，细胞在 2 h后开始贴壁， 4 h时几乎全部细胞贴壁；DMSO浓度为10%和20%的两组活力较差，细胞仍是圆形，且无贴壁现象复苏培养：解冻时从液氮罐中取出冷冻管，将其放入37 ℃水浴锅迅速融化约1~2 min（或放入37℃、5% CO2、 饱和湿度的培养箱中使其融化）将冻存管中液体加入有培养基的离心管中，1500 r/min 离心5 min，去掉上清，接种到新的培养基皿中，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，第2天更换培养液（丛珊等，2015）。
4细胞表面抗原检测由于培养细胞的形状不能作为鉴别细胞类型的主要特征标志，因此，通常都采用流式细胞术对细胞表面抗原分子进行鉴定不同的研究人员观察到 MSC 表达不同的表面标记，造成这种情况的原因有很多， 包括MSC的来源、 供者的年龄、提取的方法和扩增的条件等都会影响MSC 的表面标记（韩之波等，2012）国际上对于 MSC 的鉴定仍具争议，目前认可度较高的 ISCT（国际细胞治疗协会）间充质干细胞委员会制定的一系列标准流式细胞仪分析鉴定MSC应细胞表达黏附分子和基质细胞标记 CD73、 CD90、 CD105， 整合蛋白家族CD29，以及透明质酸盐受体 CD44，不表达造血细胞标记 CD11b、 CD34、 CD45 和 HLA-DR5生长曲线6细胞周期7分化潜能参考文献郭亚男, 关方霞, 李国栋, 李祥生, 杨波, 杜英, 胡祥, 胡炜, 焦红亮, 李远. 人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP+转基因鼠的有效性及安全性评估[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(10):1811-1818.韩之波, 王有为, 王涛, 池颖, 杨舟鑫, 及月茹, 孟磊, 杨萍, 韩忠朝. 人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离及其生物学特性研究[J]. 中国实验血液学杂志, 2013, 21（3）：754-759.韩之波, 杨舟鑫, 池颖, 王有为, 王涛, 及月茹, 杨萍, 孟磊, 韩忠朝. 人脐带胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性比较研究[J]. 中国实验血液学杂志, 2012, 20（3）：692-696.洪艳, 霍思维, 陆瑶, 章毅. 人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19):3082-3087.李艳琪, 王洪一, 姚尧, 刘晶晶, 徐潇, 张宇, 刘洋, 吴祖泽, 靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10):1609-1614.刘芳，骨髓间充质干细胞移植联合雌激素治疗宫腔粘连的实验研究[D]. 南方医科大学, 2013.刘洋, 李艳琪, 王洪一, 吴晓冰, 荆永光, 徐潇, 姚尧, 张宇, 吴祖泽, 靳继德. 胎盘源间充质干细胞分离提取的新方法[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10):1608-1612.陆琰, 陈丽, 张洹. 人胎盘间充质干细胞 4 种消化分离方法的效果比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(6):10147-1020.苗宗宁, 徐秋岚, 吕国忠, 王玲, 张学光. 间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定位及整体灌注分离培养[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(36):7133-7137. 赖平, 陈懿建, 罗耀玲, 张敏鸿, 杨建琼, 邱悦群. 人胎盘源间充质干细胞的分离、培养及生物学鉴定[J]. 赣南医学院学报，2016，36(2)：183-186.沙文琼, 王自能, 王冬菊. 人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(10):1833-1837. 徐彪, 李芳, 孙青, 许云云, 赵娟, 梁含思, 马树立, 陈永珍. 羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41):7213-7220.徐燕, 李长虹, 孟恒星, 郝牧, 邱录贵. 人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(32):6289-6294.于海微, 李佩玲, 庄如锦, 李会明. 人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及生物学特性比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(6):1021-1024.附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法脐带血分娩后穿刺脐静脉抽取50 mL 脐带血液，4℃冰箱保存，12 h 内分离，用Hank’s 平衡液稀释脐带血，稀释血液缓慢叠加于Ficoll上，离心，吸出乳白色云雾状单个核细胞，洗涤离心2 次，将获得的单个核细胞分别以5×108/L密度种植入25 cm2的塑料培养瓶中，加入完全培养基吹打，混匀。
置于37℃、含体积分数为0.05 的CO2饱和湿度培养箱中，5~7 d后全量换液，以后每3 d换液，并逐日观察细胞贴壁延伸时间、原代培养时间及细胞生长情况（于海微等，2009）距胎儿5-7cm的脐带处进行双结扎，剪断脐带，消毒母侧脐带断端，穿刺脐静脉抽取脐血40-120mL，加肝素抗凝，4h内分离（管英华等，2011）淋巴细胞分离液法: 将脐带血与无血清DMEM/F12培养基1:1体积比混合，缓慢加至含有等体积的Ficoll ( 密度为1.077g/L ) 分离液上，1800r/min离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min洗涤2次，细胞接种密度为5*107接种至25cm2培养瓶中，置于37℃，5%的CO2饱和湿度孵箱中培养，细胞融合达到80%时，0.25%胰蛋白酶消化传代（管英华等，2011）羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法: 将脐带血与6%羟乙基淀粉按4:1的体积比混合，常温下静置30-45min，取上清液，1000r/min离心10min，弃去上清，培养基重悬细胞将其缓慢加至含有等体积的Ficoll ( 密度1.077g/L )分离液上（管英华等，2011）。
脐带将无菌条件下取得的足月妊娠分娩胎儿脐带，用PBS洗3 次，去掉残留的血细胞把脐带剪切成2.0 cm左右的片段并剔除血管（1 条脐静脉，2条脐动脉），取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1 mm3的组织块，然后置于培养瓶中6 h后，加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基，放置在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养3 d 后半量换液，1 周后再次换液，此后每隔3 d 换液1 次观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80%-90%融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养瓶中，按上述方法继续培养，获得第二次组织块贴壁培养的细胞（李艳琪等，2014）贴壁细胞培养法: 在无菌条件下取出的脐带组织，用含有青霉素和链霉素的无血清DMEM/F12培养基洗涤去除残存血，去除外包膜与脐动静脉血管，将剩余组织剪碎至1mm3大小，转入T25细胞培养瓶，37℃、5%CO2饱和湿度条件下细胞培养箱中直接贴壁培养5-7d首次换液，贴壁细胞融合接近80%时，0.25%胰蛋白酶消化传代（管英华等，2011）酶消化培养法: 将以上方法处理的去除外包膜与动静脉后的脐带组织，经0.1%胶原酶和0.25%胰酶消化，无血清DMEM/F12培养基洗涤，以1.0*106/cm2接种到T2瓶（管英华等，2011）。
人脐带间充质干细胞的培养：脐带采集后在6 h内进行处理，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔，用以下3 种方法进行分离培养，3 种方法均于培养的第14天计数集落数，超过50个细胞计为集落当细胞达70%~80% 融合时，以含1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5~5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第1 代(P1) 细胞植块法：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成3.0~5.0 mm3小块，贴于预先用1 mL完全培养基( 含体积分数为2%胎牛血清、40% MCDB201 、10 µg/L血小板衍生生长因子、10 µg/L 碱性成纤维细胞生长因子、10 µg/L表皮生长因子的DF12培养基) 润湿的T25 培养瓶底壁，底壁朝上，置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转每24 h 加入1 mL上述培养基，72 h全量换液，以后每周换液2 次观察贴块周围贴壁细胞爬出情况2 周后去贴块胶原酶消化法：夹闭脐静脉一端，灌入1 g/L胶原酶Ⅱ3.0~5.0 mL ，置于含双抗的PBS中，37 ℃孵育0.5 h，收集酶液，并用PBS 反复灌洗，收集灌洗液，与酶液同时离心洗涤弃上清后，以完全培养基重悬，1×106/cm2接种于T25 培养瓶中，3 d后全量换液，以后每周换液2 次。
观察贴壁细胞生长胶原酶与胰酶联合消化法：将脐带组织切成1.0~2.0 mm3小块，直接加入1 g/L胶原酶Ⅱ于37℃孵育16 h ，以PBS 洗涤后加入25 g/L 胰酶于37℃孵育0.5 h；加入含体积分数为20%胎牛血清的培养基中和胰酶，以100 µm的滤器过滤细胞，收集滤液；PBS 洗涤弃上清后，以完全培养基重悬，按1×106/cm2接种于T25 培养瓶中，3 d后全量换液，以后每周换液2次观察贴壁细胞生长（徐燕等，2009）羊膜羊膜间充质干细胞的分离培养：选取剖宫产足月胎儿的胎盘，机械剥离胎盘羊膜组织，PBS反复冲洗，将羊膜组织剪成细碎小块，0.25%胰酶37 ℃消化10 min，100目筛网过滤PBS充分清洗后收集经胰酶消化后的组织块，继续经0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化15 min含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM终止反应后反复吹打，过100目筛网获得细胞液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液收集羊膜来源的细胞按以下培养条件进行体外培养：添加有5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10 μg/L表皮生长因子的L-DMEM完全培养基， 置于37 ℃、体积分数为5% CO2孵育箱内培养。
每3 d全量换液1次，12-14 d后细胞按常规方法传代（徐彪等，2013）hAD-MSCs的分离和培养： 无菌条件下，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-PBS液反复冲洗以清除残留血迹剪碎羊膜，加入0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na消化液，37 ℃ 旋转(200 r/min)消化10 min，弃上清，再加入消化液， 37 ℃ 旋转消化30 min，弃上清，按同样的程序再重复消化2次经胰酶消化后剩余的组织用D-PBS液冲洗，加入0.75 g/L Ⅱ型胶原酶-0.075 g/L DNase I消化液， 37 ℃、200 r/min消化2.0~3.0 h，直至组织完全消化，经 300 目 不 锈 钢 网 过 滤 ， 收 集 细 胞 滤 液 ，1 500 r/min，离心10 min，弃上清，细胞沉淀悬浮于LG-DMEM培养基(含体积分数为10%的胎牛血清、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 10 g/L非必需氨基酸、 55 μmol/L 2-巯基乙醇、 1 mmol/L丙酮酸钠、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素) 2%锥虫蓝染色检测细胞活力，以2.2×108 L-1浓度接种于培养瓶，于37 ℃ 、饱和湿度、体积分数为5%的CO2环境下培养， 3 d更换培养基。
待细胞连生面积达80%~90%后行传代培养（宫黎明等，2011）绒毛膜在产房无菌条件下获取胎盘，立即浸入胎盘储存袋[含99%低糖DMEM，1%抗生素( 双抗即青链霉素) 的组织保护液] ，在48 h内转移至实验室（洪艳等，2014）①剪取胎儿侧的绒毛膜层组织10 mL，置于直径10 cm 培养皿，平皿中装有2/3体积的含有抗生素的(1% 的青链霉素)PBS②用手术剪剪开大的组织块，一边将大的组织块剪成小块，一边用手术镊夹持进行漂洗，避免溢出，如此重复3 遍，至漂洗液清亮，弃漂洗液③转移绒毛膜层组织至50 mL 体积的离心管中，做好标记，用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约5 mm3大小的碎块④向各离心管中加入Ⅱ型胶原酶消化液，各加入Ⅱ型胶原酶10 mL ( 酶消化终浓度0.1%)，置于摇床内37℃、250 r/min振荡，约90 min 后终止消化⑤加PBS 至50 mL ，300r/min，5 min；收集上清，20 mL一管，加PBS 至50 mL ，2 000 r/min ，10 min弃上清⑥用10 mL PBS, 重悬细胞混匀并一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min。
⑦弃上清，加入10 mL完全培养基，取20μL细胞悬液加入80μL的红细胞裂解液用于细胞计数⑧按照计数结果3×106/皿，接种若干Ø100 mm 细胞培养皿，37 ℃体积分数5%CO2 培养⑨48 h 换液，以后每3 d换液1次，直至细胞可以进行传代（洪艳等，2014）细胞生长至80%时，每皿加入1.0-2.0 mL的0. 25%胰酶( 含EDTA) 进行消化传代传代时，消化三至四分钟，加含有血清的细胞培养液终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，并补加PBS至50 mL ，1 200 r/min ，离心5 min，弃含消化液的上清，加入细胞完全培养液吹打混匀，计数，按照约1.5×106/皿接种于细胞培养皿(100 mm)中，置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养（洪艳等，2014）蜕膜层将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘底蜕膜组织用无菌组织剪剪成小组织块，使用胶原酶和胰酶消化，消化后的混合液体经200目滤网过滤后，接种于细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清的DF12培养液于37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%融合时，胰酶消化细胞，按1：3传代培养（韩之波等，2013）。
胎盘胎盘标本处理：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0~3.0 mm组织后，剪下3~5个胎盘小叶，称质量约50 g，浸泡于含肝素的无菌PBS中将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色实验共采集5例标本组织消化：使用pH 7.4、含25 mmol/L HEPES的D-Hank’s作为消化缓冲液，加入终浓度为2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNaseⅠ组成消化液，每个标本需消化液330 mL冲洗后的胎盘组织分阶段消化，每个阶段在恒温气浴摇床中37 ℃、180 r/min消化20 min每次消化完毕后，小心将消化上清吸出，用新生牛血清终止反应然后将消化上清液，在25℃ 1 000 g 离心15 min，使从组织中离解出的细胞充分沉淀，再用L-DMEM重悬所得细胞悬液中含有较多消化后的组织碎片，用200目的不锈钢滤网滤除过滤后再次离心，调整细胞悬液体积到5 mL（沙文琼等，2010）人胎盘标本的留取：无菌条件下取足月剖宫产胎儿的胎盘，剥除羊膜，剪取胎儿侧胎盘组织，PBS 反复冲洗至液体较清亮，用眼科剪剪碎（陆琰等，2009）分组及干预：剪碎的胎盘组织称取质量，平均分为4组，每组5 份标本：胶原酶Ⅳ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+ 氯化铵裂解红细胞组。
将第1 组置于1 g/L胶原酶Ⅳ中，37 ℃消化45 min ；另外3 组置于1 g/L胶原酶Ⅱ中，37 ℃消化45 min然后过细胞筛网，收集各组细胞悬液，分别按以下方法进行对应分离（陆琰等，2009）羟乙基淀粉沉淀法：将收集到的胶原酶Ⅳ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组细胞悬液，分别于室温以1 000 r/min离心5 min ，弃上清用PBS 重悬细胞，加入60 g/L 羟乙基淀粉（体积比为4:1）充分混匀，室温静置45 min ，小心吸取上清，1 000 r/min 离心5 min ，弃上清，PBS 洗涤2次以完全培养基重悬，制成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数活细胞数按1.5×109L- 1密度接种于T-25 塑料培养瓶中，置于37 ℃、体积分数0.05 的CO2饱和湿度环境下，用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12进行培养7 d 后首次全量换液，弃去未贴壁细胞，每三四天换液1 次细胞达80%汇合后，用2.5 g/L胰酶消化，按1∶2的比例传代，继续扩增培养（陆琰等，2009）淋巴细胞分层液分离法：将胶原酶Ⅱ+ 淋巴细胞分层液分离组细胞悬液离心，以完全培养基重悬后缓缓加到淋巴细胞分层液上（密度为1.077 g/L），2 000 r/min离心20 min，取中间白膜层，培养基洗涤2 次。
以完全培养基重悬，制成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数活细胞数按1.5×109L-1密度接种于T-25 塑料培养瓶中其他条件同上（陆琰等，2009）氯化铵裂解红细胞法：将胶原酶Ⅱ+ 氯化铵裂解红细胞组细胞悬液离心，弃上清，以8.3 g/L氯化铵溶液4 mL重悬细胞，室温静置5~10 min后，1 000 r/min 离心5 min ，弃上清，PBS 洗涤2次以完全培养基重悬，制成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数活细胞数按1.5×109L-1密度接种于T-25塑料培养瓶中其他条件同上（陆琰等，2009）整体灌注法无菌条件下取完整的胎盘组织(保留30 cm脐带) ，置于超净工作台中，由脐静脉插入输液皮条，止血钳固定输液皮条另一端接500 mL 瓶装37℃预温的D-Hank’s，用20 mL注射器加压灌注，共5 L D-Hank’s液，直至胎盘组织变白( 红细胞完全洗净) 收集最后200 mL 灌注液，600 g 离心5 min收集细胞，调整细胞浓度为1×108L-1接种于25 cm2的培养瓶，培养基为DMEM+体积分数为10% 胎牛血清+1% penicillin-Streptomycin+ 5 µg/L 碱性成纤维细胞生长因子，37 ℃、含体积分数为5%CO2 ，饱和湿度静置培养。
细胞密度达到70%融合后用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 瓶分3 瓶的比例传代培养(苗宗宁等，2009)附件2 背景知识PMSCs具有低免疫原性这主要是因为：①胎盘在母儿体内起着重要的免疫屏障和激素分泌的作用，所以胎盘来源的间充质干细胞从理论上讲免疫原性更低，甚至不排除无免疫原性的可能，并且其分泌的免疫调节活性因子，对免疫功能排斥具有调节作用 ② 人胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性HLA又称移植抗原，能启动免疫应答参与T细胞的分化、诱导免疫应答，胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性提示了其低免疫原性的部分原因附件3 PMSC实验所需试剂试剂名称品牌包装参考价格(RMB)购买数量总价备注L-DMEM/F12Gibco 10L7271澳洲胎牛血清Corning500mL48881PBS(不含钙镁)Corning500mL606Penicillin-StreptomycinGibco100mL24010.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol RedGibco 100mL1781胶原酶ⅡGibco 1g31141bFGFGibco10ug25001羟乙基淀粉阿拉丁250g6491Essential 8™ MediumGibco500mL29071Vitronectin (VTN-N)Gibco1mL7551来自丁香客：组织贴壁法材料准备：无菌生理盐水或PBS，手术剪，虎齿镊，组织剪步骤：(1)．从含有1‰双抗的无菌生理盐水中取出新生儿脐带，用生理盐水漂洗若干次，直至洗净血渍。
血管变形处以及开口两端，弃去不要2)．用组织镊剥弃脐带皮和血管（2条动脉、1条静脉，沿着静脉剪开，再把静脉内膜小心撕出，动脉则直接用镊子使劲拉出），留下内膜，内膜即为华通氏胶（Whalton’s Jelly），放入生理盐水中洗涤2-3次3). 将组织块剪成1.5mm左右大小，将其均匀铺于T75培养瓶中4). 将铺好组织块的培养瓶小心翻转，使其铺有组织块的底面朝上，然后加入约8mL完全培养基5). 隔天轻轻将培养瓶翻转，使培养基微微浸泡到组织块6). 培养15天后，用培养基或PBS吹打并收集培养皿中依旧贴壁的组织块，以300g速度离心5min后，去上清再将沉淀的组织块铺于T75培养瓶中，在底部加入约8mL完全培养基7). 隔天轻轻将培养瓶翻转，使培养基微微浸泡到组织块8). 再过7天后观察细胞爬出情况，此时爬出的细胞记为P09). 收集培养皿中的组织块，以300g的速度，离心5min后，去上清，再将其铺于T75培养瓶中并在底部加入约8mL培养基10).收集爬出的细胞，以8000-10000/cm2的密度重新接种至培养皿中，并记为P1，待P1细胞长至80%融合时，即可传代11).重复(7)-(10)步骤5-6次。
每次爬出的细胞都为P0按照步骤(10)的方法传代细胞23参11考。