蛋白质复性的条件及影响因素

蛋白质复性的条件及影响因素一cropped摘要 蛋白质复性是一个过程 ,存在中间阶段 ,此阶段的各种相互作用 力决定了蛋白质能否复性 蛋白质复性要求有一定的条件，如p H、温度、离子强度、蛋白质浓度等另外 多种添加剂能促进蛋白质复性 ,其中包括表面活性剂 、低浓度变性剂 、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 ，但对于不同 蛋白质 ，因其结构及理化特性不同 ，采取不同复性方法 ，可以使其达到最佳复性效果 关键词 蛋白质 ; 结构与复性 蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分，某些脯氨酸异构酶在含有脯 氨酸的变性蛋白结构质中被证明对复性有辅助作用 来源于不同物种中子物质 ，易受外界条件 的影响发生变性 随着基因的同一蛋白质在氨基酸排列顺序上会存在不同程度工程技术的发展 ，许多 实验通过将目的蛋白基因转 入原核或真核表达体系进行表达的方法 ，得到需 要的差异，但其折叠方式却有很大的保守性Wal23 的蛋白质 ，这大大丰富了蛋白质的来源 但这些蛋 lace 研究了来 源于大肠杆菌 、人和乳酸杆菌的二氢 白质 ，由于表达体 系 本 身 的 原 因 ， 或 实 验 过 程 的 处 叶酸还原酶的复性 ，虽然这 3 种蛋白在氨基酸顺序 理 ，多以无活性的形式存在 ，需要进行复性 。

因此 ， 上只有 30 %相同 ，但是 却具有相同的复性途径和两 对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生 个中间体 蛋白质的空间结构由一系列化学键来维 物工程研究到最终临床应 用过 程 中 不 可 避 免 的 一 系 ，其中二硫键是维系蛋白质结构完整的重要 共价 步 本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研 键 ，二硫键的打开或 错误搭配会引起蛋白质高级结 究作一综述 构的丧失 ，恢复二硫键结构是蛋 白质复性的重要一步 在蛋白质的复性过程中 ，存在一系列的结构相 1 蛋白质的结构与复 性 ，这些中间体分子表面有许多疏水基团似的中间体蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常 暴露 ，对聚集较敏感 ，易于 形成沉淀 同时 ，分子内 复杂的空间立体结构 ，其组成中的氨基酸本身的特 部氨基酸之间存在使蛋白质正 确 折 叠 的 天 然 作 用 性是蛋白质高级结构 形成的决定因素和结构基础 ， 力 ，蛋白质的复性过程就是这些中间体向两个方 向 尤其是处于关键部位的氨基酸 ，对蛋白质的生物学 4 选择性的演变过 程，蛋白质复性效率就取决于正 功能有根本的影响 ，例如镰刀型红细胞贫血症 中血确折叠和变性聚集之间的竞争 。

疏水链暴露后 ，肽红蛋白氨基酸的变 化 因此 ，能达到复性的蛋白质 变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不 变的基 链上某些具有光吸收作用的氨 基 酸 也 暴 露 于 溶 液 础上 ,由于 其他因素的影响而引起的分子高级结构 中 ,会引起蛋白质紫外吸收值发生一定 的变化，根据aB的变化，如2螺旋、2折叠结构的增减，肽链的变性这 一点 ,可以对变复性过程中蛋白质的结构情况进 舒展 ,杂乱结构的增多 ,从而 使蛋白质正常的生物学 行观察 蛋白质的变性过程发生是比较迅速的 ，只 活 性丧失 蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有 要几分钟 ，但复性过程却相 对较慢 ，需要几个小时 ， 关系 ，例如含有巯 基 的 氨 基 酸 ， 最 常 见 的 是半胱氨因此 ，复性时要给予足够的时间 酸 ，会降低蛋白质在高温条件下的稳 定性，尤其在某+ 2 +些金属离子，Cu、Zn等存在时，蛋白质对空气中2 蛋白质复性条件1 的氧更为敏感 ， 而易发生不可逆变性， 在此基础上 ，有人通过用丝氨酸 、丙氨酸替换活跃的半胱氨酸 蛋白质的复性对环 境中的理化条件有很高的要 2 的方法来提高蛋白质的稳定性，这当然要在不影 求 ，复性时必须对温度 、p H 、离子强度等进行严格的 响蛋白质的生物学活 性的基础上才有意义 。

脯氨酸 限制 ，同时蛋白质本身的性状也对复性效率产 生影 本身存在顺反两种异构形式 ，也会影响蛋白质空间 5 响 朱慧等在 研究重组人前尿激酶复性时 ，对不同复性条件进行实验比较 ，发现强酸强碱均不利于(( ) ) 蛋白质复性 ，偏碱 p H8 . 6，8 . 8、低温 4 ?情况下11 Hevehan的研究表明，这一比例关系需随蛋白质，浓 蛋白质复性较好 蛋白质浓度对复性也有影响6 度越低 ，聚集越不易发生原因是由于蛋白质的 浓度作调整 ，实验 中还原型和氧化型巯基试剂比例 浓度上升时 ，分子间相互碰撞的几率增加 ，处 于中间 介于 3 ?1，1 ?1 之间时 ，蛋白质达到最大复性 空12 状态的蛋白质对聚集又较敏感 ，使蛋白质趋于凝集气中的氧是很好 的二硫键催化剂 ，Menzella 等的 而不能正确折叠 ，已复性后的蛋白质分子则 不易发 研究成功地利用空气中的氧使 前 凝 乳 酶 原 达 到 复 生聚集 但 是，实际的应用要求在高浓度下达到蛋性，复性中需要监测溶液p H值，而 且适量加入精氨酸和中性表面活化剂可提高复性效率 ，这不失为一 白质的复性 ，许多人尝 试用改变实验步骤的方法来克服这一问题 。

朱慧等将复性分步进行 ，在一定的 ，有望在大规模生产中 应用的方法 种降低复性成本 时间间隔下分步加入蛋白质 ，给蛋白质有效的 时间 利用空气中的氧复性时 ，金属离子往往被用来作为进行低浓度下的复性 ，结果提高了复性效率 ，并比较催化剂 7 不同的时间间隔 ，发现 60min 为最佳 周明乾等312 分子伴侣对 复性的影响()在纯化白介素22 IL22和粒细胞2巨噬细胞集落刺激 分子伴侣是一种 较新但已屡次得以验证了的蛋()因子GM2CSF融合蛋白时，对溶解变性包涵体通过白质复性辅助剂 它能结合和稳定解链或半折叠的() 一步稀释 80 倍和分步稀释法分别进行复性 ，前种 蛋白质结构 ，降低 蛋白质聚集并有效促进蛋白质折 方法目的蛋白有析出 ，回收率低 ，其原理也是 通过避 叠 目前已从不同来源得到多种分子伴侣并应用于13 免高浓度的蛋白质中间体同时存在于溶液中 蛋白 蛋白质复性,Nam从大肠杆菌中诱导并纯化得到质分子正确折叠对溶液的离子强度也有 要求 ，适当 Dnak ，Dnaj ， Grp E ， Gro EL ， Gro ES 5 种 分 子 伴 侣 ， 它 们盐浓度 有 利于蛋 白 质 内部各种 化学键的 形成。

能促进 碳酸酐酶 B 的复性 分子伴侣的复 性 机 制8 Tayyab用1 . 0 mol/ L KCl显著提高了在脲素中变性与ATP关 系密切 , Gro EL 与目的蛋白结合后 ,随即与9 的牛血清白蛋白的复性效率 国内孙叶芳对在大 Gro ES 结合 ,两 者共同为蛋白质肽段提供一 个封闭( ) 肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白 的折叠环境 rhBMP22, 然后结 合 ATP , Gro EL 结构发 生 改 变 , 进行纯化及 复性时 , 结果显示高盐 不 能使 rhBMP22 释放出蛋白质进行复性 另外发现 , Gro EL 还 会 改14 获得 良好复性 , 其他条件相同时 ,0 . 75,1 . 25 mol/ L 变蛋白 质复性途径Hsp78存在于酵母线粒体的NaCl最有利于蛋白二 聚体的形成 ,活性最高 ,因 中 ,具有水解 ATP 及发挥分子伴侣作用 , 在 ATP 的 此 ,溶液中的盐也是蛋白复性中应考虑的一项重要 参与下 , Hsp78 与 Sclp 、Mdjlp 、Mgelp 协同作用可使荧15 (aa)光蛋白复性2晶体蛋白2crystallin是一种小因素。

)分子量的蛋白质16,30 kD，在所有物种中均有表3复性的辅助剂16 a达Keyang的实验中2晶体蛋白和变性的萤光变性后的蛋白质由于氨基酸的完整顺序没有变 素酶结合后 ,在 ATP 的预 先作用后再加入 Hsp70 ,2 h 化 ,本身自然存在着向活性蛋白折叠的趋势 ,有 许多a后萤光素酶活性恢复，ATP的结合引起2晶体蛋白蛋白质用透析等方 法去掉变性环境后 ,自身即可完 结构的变化 ,释放出目的蛋白 ,以利于其他分 子伴侣成复性过程，最为典型的如核糖核酸酶，但对多数蛋17 a发挥作 用Nathy用2晶体蛋白对木聚糖合酶进白质来说，复性需要一些辅助剂的 加入 这些添加行复性 ，并检测复性过程中蛋白质结构的变化情况 ， 剂具有分子量小 、 易于和蛋白质结合 、较稳定 、不易聚集等优点其作用机制不尽相同a2晶体蛋白先与木聚糖合酶中间 体结合形成一无a活性的“融球”状复合物，加入ATP后，2晶体蛋白311二硫键催 化剂的结构 发 生 变 化 ， 释 放 出 目 的 蛋 白 他 们 还 发 现 ， 各种 氧化还原对可以使二硫键在正确位置上氧2 + Ca可以提高酶活性的恢复，虽然体内木聚糖合酶 化形成，象 cysteine/ cystine、GSH/ GSSG。

用此进行复2 +的复性并不需要Ca参 与 由此可见 ，蛋白质复性 性时 ，不同氧化还原物质之间的浓度比例是决定 蛋9 中分子伴侣的结合遏制了蛋白质的聚集 ，而 ATP 的 白 质 复 性 的 重 要 因 素 孙 叶 芳对 纯 化 出 的加入可使分子伴侣将目的蛋白由结合态游离出来 ， rhBMP22 单体按不同 实 验 条 件 分 8 组 进 行 复 性 ， 发进行折叠 ，而且 ，多种分子伴侣对复性有协同作用 ( ) ( 现在 10 ?1 条件下的 GSH 2 mmol/ L 和 GSSG 0 . 2在分子伴侣作用机制的基础上，有人用人工分子伴)mmol/ L能最大 程 度 的 促 进 rhBMP22 的 活 性 恢 复 10 侣系统对蛋白质进行复性 人工分子伴侣由去 垢剂在蛋 白 质 hainantoxin2IV. 的 复 性 中 ， 也 验 证 了 这和环糊精组成 去垢剂可以与蛋白质结合 ，形 成复( ) 一点 GSH : 5 mmol/ L ， GSSG: 0 . 5 mmol/ L 最 近 ，合体 ，抑制蛋白质聚集 ，然后环糊精从复合体中它们的分子内部大都含有 C = N 、C = S 等类似共价 参 考 文 献 ( )(键结构，如盐酸胍和精氨酸C = N，二甲基亚砜S1 Sandberg A et al . Biochem， 2002 ;41 :1060 ) ( ) = 0，乙酰化环 糊精C = 0等，这种结构可能与蛋2 Kretschmar et al . Mol Biol ，1999 ;291 :1147 白质疏水基团的结 合有关 。

在对蛋白质进行透析复 () 3 Wallace LA et al . J Mol Biol ， 2002 ;315 2:193 性的基础上 ，可适当应用这些添加剂 ) 4 Capaldi AP et al . Nat Struct Biol ， 2002 ;9 3:2095 4 工程蛋白质的复性() Zhu H et al . Chin Med J ， 2001 ;114 2:186 方 () 敏等 . 生物工程学报 ，2001 ;17 6:608 林来6 从组织器官中 消化提取可以得到蛋白质 ，但往 兴妹等 . 第一军医大学学报 ，2001 ;4 :245 7 往产量较低 ，方法复杂 ，随着基因工程技术的发展 ， () Tayyab S et al . J Biol Macromol ， 2002 ; 30 1: 17 8 利用原核或真核表达体系表达蛋白质 的方法可以解 孙叶芳等 . 牙体牙髓牙周病学杂志 ，2001 ;2 :739 决这一问 题 原核表达体系具有易控制 、周期短 、产 ( ) 刘中华等 . 生物化学与 生物物理学学报 , 2002 ; 34 4:10 量高的优点应用较多 。

但由于自身的特 点 ,加上蛋516白质的高产量表达 ,得到的蛋白质多以无活性不溶 Heven DL ,Clark EDB. Bitechnol Bioeng ,1997 ;54 :221 11 的包涵体 的形式存在 ,对于此类蛋白质要先经过变() Menzella HG et al , Protein Expr Purif ,2002 ; 252:248 12 性 溶解后再恢复活性 由于菌体中成分复杂 ,含有() Nam SH et al . Protein Expr Purif , 2002 ;24 2:282 一些蛋白 酶等对蛋白有害的物质 ,因此对包涵体进 13Bhutani N et al . J Mol Biol ,2001 ; 314 :1167 行洗涤以除去这些杂 质是非常必要的 蛋白质的纯 14度对复性也有影响 ,高纯化的蛋白质更易达到复性 Kuzewska J et al , J Mol Biol , 2001 ;314 : 901 15许多实验中 ,在目的蛋白的一端可以连上一段小的 Wang K , AbrahanSpector. Eur J Biochem ,2001 ;268 :6335 16 19 20 肽段 ,如 :组 氨酸、谷胱甘肽2S2转移酶等，然后()Na th D et al . Pro tein Sci , 2002 ;11 11:2727 17用镍螯合的层析柱进行特异性的纯化 ，一方面大大 () Dong X Y et al .Biotechnol Prog ，2002 ;18 3:663 18提高了所得蛋白质的纯度 ，另一方面 ，由于柱本身对 () Gray LR et al . Expr Purif ， 2002 ;26 1:179 19 蛋白质起一定程度的隔离作用 ，许多蛋白质 在洗脱 () Cho TH et al . Bioseparation ， 2001 ;10 425:189 20 下来时 ， 已具有一定活性 。

)(2003202217收稿 5 前景与展望由于不同蛋白质有不同分子大小 、结构形式和 蛋白组学及其在肿瘤研究中的应用3邓明会向 阳 湖北民族学院医学院病理教研室 ()湖北恩施 ， 445000 3 湖北民族学院 医学科学研究所摘要 蛋白组学是通过生化的方法研究细胞内全部蛋白质组成和动态变 化的一门新兴学科 ，在医学生物学研究领域的各个方面都具有巨大的潜力 ，尤其为肿瘤研究提供了崭新的思路 与技术2DE2MS蛋白组学研究技术，包括蛋白质标本准备 、蛋白质分离纯化 、蛋白分析鉴定及数据库等方面 ， 目前已应用于肿瘤的发病机制探讨 、早期诊。