实验四 叶绿素的提取分离和性质一、实验目的1. 了解溶剂提取法的原理及方法2. 了解叶绿素中含有的色素以及分离方法3. 掌握薄层层析法和柱层析法的原理、方法及操作事项二、实验原理1. 溶剂萃取法:根据原料中被提取成分的极性、共存杂质的理化特性遵循相似相溶的原则， 使有效成分从原料固体表面或组织内部向溶剂中转移的传质过程即溶剂从溶剂主体传 递至固体或组织表面，溶剂扩散渗入固体内部和内部微空隙内，化学成分溶解进入溶剂， 通过固体微空隙通道中溶液扩散至表面，成分从固体表面传递至溶剂主体2. 薄层色谱法： 又叫薄层层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要 的实验技术，属固—液吸附色谱一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至 0.01 微克） 的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此 法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质此外，薄 层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”例如在进行化学反应 时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10x3cm左右）上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线 上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。
待展开剂前 沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色试样中各组分的分离效果可用比移值来衡量原点至斑点中心的距离—a比移值Rf： Rf原点至溶剂前沿的距离—L一次层析 二次层析：在薄层层析时通过两次不同方向的流动相展开，以期获得样品 的进一步分离的方法一般是在第一次层析分离后，变换 90°方向用相同或不同的溶剂 系统进行第二次层析3. 柱层析法：柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法其原理是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离当 采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程，吸附力较强的组分， 移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱三、 实验仪器与试剂四、 实验步骤1. 薄层板的制备（提前完成）： 硅胶板和氧化铝板各4块，小的3块，大的1块1%羧甲基纤维素钠配制（注意：羧甲基纤维素钠不好溶解在水中，所以溶解的过程中需 要加热和搅拌，但是搅拌力度要掌握，溶液中尽量避免不要有气泡）；12ml 1%羧甲基纤维 素钠与10g中性氧化铝或硅胶混于烧杯中，调成糊状；取干净的载玻片，将上述糊状物倒于 其上，振抖载玻片，使中性氧化铝或硅胶均匀涂于载玻片上，放平，阴干（要求表面要平整 均匀，不能有裂痕）。
2. 色素的提取及浓缩取 5g 新鲜的绿叶洗净擦干后，用剪刀剪碎后 于研钵中捣烂，过程中加入少许的乙醇， 促使细胞壁破裂，依次用10ml乙醇、5mlX2石油醚提取，将合并的提取液放到50ml的分 液漏斗中，用10mlX2水洗，弃去水层，石油醚层用少量的无水硫酸钠干燥，然后将石油 醚层转移到带支管的试管内，用水浴加热，浓缩到0.5m l,盖上瓶塞注意石油醚很容易挥 发，如果浓缩量太少，样品容易干3. 薄层层析点样：使用在前100度烘箱烘1h（活化薄层板？）在薄层板一端1cm处用铅笔轻轻划一 道线；用细的毛细管蘸取混合液，点上，滴点时要小而圆，不可破坏薄层板层析：三个层次缸中分别装入少量的展开剂，苯炳酮= 7/3,石油醚/乙酸乙酯= 6/4,石 油醚/乙酸乙酯/二乙胺=58/30/12,展开剂装入高度约0.5cm（不要让展开剂溅起落到混样上） 盖上缸盖；观察展开剂前沿上升，当到离板上端约1cm处时，取出尽快用铅笔在前沿处 划上一记号晾干；计算各纯样的 Rf 值双向层析：在薄层板上（7.5cmX7.5cm）距底边和左侧皆为1cm处点样，操作同上，展 开剂到达离上端15cm处时，取出，在空气中完全干燥后，再以所显现的色点为样品点， 进行二次展开，两次的展开剂都为苯/丙酮=7/3。
4．柱层析装柱：层析柱垂直放置，用25ml锥形瓶作洗脱液的接收器将中性氧化铝粉末通过长颈 漏斗加到色谱管的 1/3 处，再从上口倒入一干燥的烧杯中，加入适量的流动相（根据薄层层 析选择合适的），调节其稠度；向柱中加入流动相至1/4处，打开活塞，控制流出速度为1 滴每秒，此时从柱上端通过一干燥漏斗，慢慢加入调好的氧化铝和流动相混合物，用玻棒轻 轻敲打柱身，使其装填均匀整个过程保持流动相面要高于氧化铝装完柱后剪一直经与色 谱柱相当的滤纸片，用玻棒轻轻将其覆盖在氧化铝上，中间不能有空气；整个过程一直保持 流速不变，液面不能低于氧化铝的上面分离：当溶剂液面刚好流至滤纸面时，立即沿柱壁加入2滴混合样，当混合样流近滤纸面 时，立即沿柱壁慢慢加入 5ml 流动相，注意不能溅起氧化铝，当溶剂液面刚好流至滤纸面 时，立即沿柱壁再加入溶剂，如此反复，直至洗净为止五、 实验结果与处理（1） 载玻片上提取液的色斑点数为 ，由色斑点数可知提取液中的物种为：—（2） 载玻片上各色斑中心位置与展开剂前沿位置记录于表中（3） 分离物的检测六、 实验小结。