微生物学实验四微生物学实验四肠道致病菌别离鉴定肠道致病菌别离鉴定微生物学教研室 郭棵棵综合性实验录像：球菌录像：球菌操作：操作：1 1、化脓性球菌别离鉴定二、化脓性球菌别离鉴定二 1 1革兰染色革兰染色 2 2转种甘露醇或血清肉汤转种甘露醇或血清肉汤 3 3血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验 4 4触酶实验触酶实验 2 2、肠道菌别离鉴定一、肠道菌别离鉴定一 粪便标本接种平板粪便标本接种平板材料：材料：1 1载玻片载玻片 1-2 1-2 张张/人人 2 2甘露醇或血清肉汤甘露醇或血清肉汤 1 1支支/人人 3 3新鲜兔血浆、生理盐水新鲜兔血浆、生理盐水 各各1 1支支/6/6人人 4 4平板平板 1 1块块/人人 5 5粪便标本：伤寒、痢疾、副甲、副乙粪便标本：伤寒、痢疾、副甲、副乙 1 1套套/教室教室实验内容实验内容了解：肠道致病菌的血清学鉴定了解：肠道致病菌的血清学鉴定 触酶实验、血浆凝固酶实验的原理触酶实验、血浆凝固酶实验的原理掌握：掌握：1.1.肠道致病菌别离鉴定的方法、步骤及生化反响肠道致病菌别离鉴定的方法、步骤及生化反响 2.2.化脓性球菌转种甘露醇或血清肉汤的目的化脓性球菌转种甘露醇或血清肉汤的目的 3.3.触酶、血浆凝固酶实验的结果观察触酶、血浆凝固酶实验的结果观察 教学目标教学目标 观察上次实验结果、进展分析观察上次实验结果、进展分析紫外线杀菌实验紫外线杀菌实验抗生素敏感试验抗生素敏感试验 抑菌圈直径抑菌圈直径 如果细菌对药物敏感，那么在药片周围有抑菌如果细菌对药物敏感，那么在药片周围有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：圈形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：20mm 20mm：极度敏感：极度敏感 5-20mm 5-20mm：中度敏感：中度敏感 10-15mm 10-15mm：轻度敏感：轻度敏感 10mm:10mm:不敏感不敏感 无抑菌圈无抑菌圈:耐药耐药化脓性球菌别离鉴定二化脓性球菌别离鉴定二 脓汁脓汁血平板血平板菌落菌落葡萄状排列葡萄状排列链状排列链状排列血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验甘露醇发酵实验甘露醇发酵实验血清肉汤管血清肉汤管接种接种三线法三线法3724h革兰染色革兰染色触酶实验触酶实验排列不典型排列不典型2、操作、操作 革兰染色及镜检革兰染色及镜检 触酶实验触酶实验 血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验 转种甘露醇或血清肉汤转种甘露醇或血清肉汤u 涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌落涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌落 u 在盐水中乳化，涂成直径约为在盐水中乳化，涂成直径约为1.0 cm1.0 cm的膜。
的膜u 枯燥：最好在室温中自然枯燥，也可在远离火焰上枯燥：最好在室温中自然枯燥，也可在远离火焰上 u 方微微烘干但切勿靠火焰以免烤焦标本方微微烘干但切勿靠火焰以免烤焦标本u 固定：火焰固定固定：火焰固定u 革兰染色过程：革兰染色过程：u 初染：初染：结晶紫结晶紫 1 1分钟分钟u 媒染：媒染：碘液碘液 1 1分钟分钟u 脱色：脱色：95%95%酒精酒精 半分钟半分钟u 复染：复染：稀释复红稀释复红 半分钟半分钟u 镜检：球阳杆阴镜检：球阳杆阴 阳紫阴红阳紫阴红 1 1革兰染色革兰染色葡萄球菌葡萄球菌链球菌链球菌H2O2catalase2H2O+O22 2触酶实验触酶实验原理：原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢产生过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和分子氧出现气泡生成水和分子氧出现气泡操作步骤：操作步骤：在干净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许在干净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与生理盐水中乳磨均匀，然后加细菌培养物与生理盐水中乳磨均匀，然后加3 3过氧过氧化氢数滴；或直接滴加化氢数滴；或直接滴加3 3过氧化氢于不含血液的细过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
菌培养物中，立即观察结果结果观察：结果观察：有大量气泡产生者为阳性不产生气泡有大量气泡产生者为阳性不产生气泡者为阴性者为阴性G G+球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于G G+球菌的球菌的初步分群初步分群 3 3血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 1原理 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，在血浆中激活剂的作用下，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，导致血浆凝固；而非致病性葡萄球菌由于不产生此酶，故不能凝固血浆，二者可据此予以区别2 2操作：玻片法操作：玻片法 取干净玻片一块取干净玻片一块 血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端 用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充分混匀浆充分混匀 结果观察：结果观察：3030秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而兔血浆那么呈块状或颗粒状者为阳性浊，而兔血浆那么呈块状或颗粒状者为阳性4 4甘露醇试验或血清肉汤接种甘露醇试验或血清肉汤接种 1甘露醇发酵试验：接种甘露醇单糖管，观察颜色改变及气体产生 情况。
发酵甘露醇产酸者，使酸碱指示剂溴麝香 草酚兰在酸性环境下由蓝色转变为黄色2接种血清肉汤：观察细菌生长状态 沉淀生长？混浊生长？局部沉淀，上清液混浊生长？肠道菌别离鉴定一肠道菌别离鉴定一 肠道杆菌是一大群寄居在人类和动物的肠道中的生物肠道杆菌是一大群寄居在人类和动物的肠道中的生物学性状近似的学性状近似的革兰阴性革兰阴性的杆菌，该类细菌的杆菌，该类细菌无芽胞无芽胞，多数有多数有周鞭毛周鞭毛需氧或兼性厌氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合需氧或兼性厌氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合物，产酸、有些产气物，产酸、有些产气多数肠道菌是肠道的正常菌群，当宿主免疫力降低或多数肠道菌是肠道的正常菌群，当宿主免疫力降低或侵入肠道外等部位时，也可成为条件致病菌引起疾病有侵入肠道外等部位时，也可成为条件致病菌引起疾病有的肠道杆菌例如伤寒沙门菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌的肠道杆菌例如伤寒沙门菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌等，是肠道致病菌，可导致人类某些肠道传染病等，是肠道致病菌，可导致人类某些肠道传染病肠道菌的种类繁多，为成功地检出病原菌，通常肠道菌的种类繁多，为成功地检出病原菌，通常选用选择或鉴别培养基除提供细菌生长所需营养物选用选择或鉴别培养基。
除提供细菌生长所需营养物外，还含有抑菌剂和指示剂可有选择性抑制某些肠外，还含有抑菌剂和指示剂可有选择性抑制某些肠道细菌的生长，指示剂那么能鉴别细菌的生化特性道细菌的生长，指示剂那么能鉴别细菌的生化特性本次试验以粪便为标本进展肠道菌的别离鉴定本次试验以粪便为标本进展肠道菌的别离鉴定粪便标本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以粪便标本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌等肠道菌，要求从标本中别离出单一的致及大肠杆菌等肠道菌，要求从标本中别离出单一的致病菌，并通过后续的试验鉴定出致病菌病菌，并通过后续的试验鉴定出致病菌琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分，琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分，不仅能抑制不仅能抑制G G+菌的生长，也能抑制肠道菌的生长，也能抑制肠道非致病菌非致病菌的的生长琼脂培养基琼脂培养基 大肠杆菌在此平板上生长，可分解培养基中乳大肠杆菌在此平板上生长，可分解培养基中乳糖产酸，与胆盐作用形成胆酸沉淀，使中性红指示糖产酸，与胆盐作用形成胆酸沉淀，使中性红指示剂变红，形成红色浑浊不透明菌落肠道致病菌那剂变红，形成红色浑浊不透明菌落肠道致病菌那么不分解乳糖，形成无色或淡黄色菌落因分解蛋么不分解乳糖，形成无色或淡黄色菌落因分解蛋白质产生碱性物质。
白质产生碱性物质SSSS琼脂培养基琼脂培养基Salmonella-Shigella agarSalmonella-Shigella agar 大肠埃希菌大肠埃希菌沙门菌沙门菌志贺菌志贺菌操作：操作：粪便粪便S.S.S.S.平板平板挑选可疑菌落挑选可疑菌落培养培养24h24h3737接种接种三线法三线法1 1、用无菌接种环挑取少量粪便标本，用划线法、用无菌接种环挑取少量粪便标本，用划线法 接种于平板上进展别离培养接种于平板上进展别离培养2 2、放置于、放置于37C37C孵箱内培养孵箱内培养18-2418-24小时，观察平板小时，观察平板上所生长的菌落，依据其形态大小，透明度和颜上所生长的菌落，依据其形态大小，透明度和颜色等特点，初步识别致病菌和非致病菌色等特点，初步识别致病菌和非致病菌操作：操作：化脓性感染采取哪些标本送检有辅助诊断意化脓性感染采取哪些标本送检有辅助诊断意义？义？为什么要用血浆凝固酶试验鉴别致病性与非为什么要用血浆凝固酶试验鉴别致病性与非致病性葡萄球菌？致病性葡萄球菌？思思 考考 题题祝您成功！。