实验二实验二细菌的抹片制备及染色细菌的抹片制备及染色一一 概述概述 细菌细胞微小，无色而透明，直接在普通细菌细胞微小，无色而透明，直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色后，则能较清楚地显示其制成抹片和染色后，则能较清楚地显示其形态和结构，也可以根据不同的染色反应，形态和结构，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据作为鉴别细菌的一种依据二二、目的要求、目的要求1.掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色2.认识革兰氏染色的反应特性认识革兰氏染色的反应特性三三 实验材料实验材料1.载玻片载玻片 接种环接种环 酒精灯酒精灯 火柴火柴 生理盐水生理盐水 各种各种染液等染液等2.菌种：大肠杆菌菌种：大肠杆菌 葡萄球菌葡萄球菌 三、实验内容三、实验内容 1.细菌抹片的制备细菌抹片的制备要求：载玻片应清晰透明，洁净而没有油渍要求：载玻片应清晰透明，洁净而没有油渍v 抹片：（抹片：（1）.对于液体材料对于液体材料:可直接用接种环可直接用接种环取一环材料均匀的涂布在玻片的中央取一环材料均匀的涂布在玻片的中央。
2）.非液体材料：先用接种环取少非液体材料：先用接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后用量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后用接种环取少量材料均匀涂布成适当大小的薄层接种环取少量材料均匀涂布成适当大小的薄层v 干燥：上述涂片应让其自然干燥干燥：上述涂片应让其自然干燥 固定固定：做好的涂片染色前必须先固定目的是杀死细菌，做好的涂片染色前必须先固定目的是杀死细菌，同时增加细菌对染料的亲和力同时增加细菌对染料的亲和力固定方法有两种：固定方法有两种：1、火焰固定：将干燥好的抹片，使其抹面向上，以、火焰固定：将干燥好的抹片，使其抹面向上，以其背面其背面 在酒精灯外焰上略做加热在酒精灯外焰上略做加热2、化学固定：将以干燥的抹片浸入甲醇中、化学固定：将以干燥的抹片浸入甲醇中2-3分钟，分钟，自然挥发干燥自然挥发干燥做好的抹片就可以进行各种染色方法了做好的抹片就可以进行各种染色方法了2.染色方法染色方法几种常用的染色方法：美蓝染色法，瑞士染色法染色法，几种常用的染色方法：美蓝染色法，瑞士染色法染色法，抗酸染色法，革兰氏染色法重点介绍革兰氏染色法抗酸染色法，革兰氏染色法重点介绍革兰氏染色法革兰氏染色法：革兰氏染色法：（1）.在已干燥，固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫在已干燥，固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经溶液，经1-2分钟水洗。
分钟水洗2）.加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1-3分钟，水分钟，水洗3）.加加95%酒精于抹片上脱色，约酒精于抹片上脱色，约20秒，水洗秒，水洗（4）.加稀释的石碳酸复红复染加稀释的石碳酸复红复染1分钟，水洗分钟，水洗5）.吸干或自然干燥，镜检革兰氏阳性菌呈蓝吸干或自然干燥，镜检革兰氏阳性菌呈蓝紫色紫色，革兰氏阴性菌呈革兰氏阴性菌呈红色红色革兰氏染色法的原理革兰氏染色法的原理：革兰氏阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，经革兰氏阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，经95%酒酒精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色紫色v 革兰氏阴性菌的细胞壁其脂类含量较多，当以革兰氏阴性菌的细胞壁其脂类含量较多，当以95%酒酒精脱色时，脂类被溶去，使得细胞壁空隙变大，尽管精脱色时，脂类被溶去，使得细胞壁空隙变大，尽管95%酒精处理能使肽聚糖空隙缩小，但因其肽聚糖含量较少，酒精处理能使肽聚糖空隙缩小，但因其肽聚糖含量较少，细胞壁缩小有限，故让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物细胞壁缩小有限，故让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被被95%酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成成红色红色。
瑞士染色：瑞士染色：瑞士染色瑞士染色:是组织快速染色，检测有没有细菌是组织快速染色，检测有没有细菌的存在步骤：滴瑞氏染液至载玻片上，步骤：滴瑞氏染液至载玻片上，3-5min用水用水冲洗抗酸染色法：抗酸染色法：细菌抹片的制备：细菌抹片的制备：涂片卡介苗（结核杆涂片卡介苗（结核杆菌）涂抹在玻片上然后干燥，火燃固定菌）涂抹在玻片上然后干燥，火燃固定1）.滴加复红几滴在酒精灯上加热滴加复红几滴在酒精灯上加热3-5min至冒蒸气，冷却后用水冲洗至冒蒸气，冷却后用水冲洗2）.用酒精脱色用酒精脱色30s-1min（3）.美兰复染美兰复染1min 结果：抗酸性呈结果：抗酸性呈红色红色，非抗酸性呈，非抗酸性呈蓝色蓝色镜检镜检 将革兰氏染色的进行显微镜油镜检并画图将革兰氏染色的进行显微镜油镜检并画图实验二、实验二、培养基的制备培养基的制备一、一、目的要求目的要求 1.掌握一般培养基制备的原则和掌握一般培养基制备的原则和要求要求 2.熟悉一般培养基制备的过程熟悉一般培养基制备的过程 3掌握培养基酸碱度的测定掌握培养基酸碱度的测定二、二、培养基的概念和类型培养基的概念和类型培养基培养基(medium)是人工配制的适合微生物生长繁殖或是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
任何培养基中均需含有微积累代谢产物的营养基质任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求又有很大差异，所以培养基一般用于细菌元素的要求又有很大差异，所以培养基一般用于细菌的分类、鉴定、菌种的保藏的分类、鉴定、菌种的保藏根据原料来源不同，可将培养基分为根据原料来源不同，可将培养基分为合成培养基、半合成培养基、半合成培养基与天然培养基合成培养基与天然培养基根据物理性状可分为三大类：根据物理性状可分为三大类：液体培养基、半固体培液体培养基、半固体培养基、固体培养基养基、固体培养基三三、制作的一般要求、制作的一般要求 1.培养基必须含有细菌生长所需要的营养物培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质2.培养基的材料和盛培养基的容器没有抑制培养基的材料和盛培养基的容器没有抑制细菌生长的物质细菌生长的物质3.培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求多数细菌生长适宜多数细菌生长适宜pH范围是弱碱性范围是弱碱性(pH7.2-7.6)。
4.所配制的培养基应该是透明的，而且要彻所配制的培养基应该是透明的，而且要彻底灭菌四四、实验材料、实验材料 器皿：量筒、器皿：量筒、试管试管、pH试纸试纸、天平、天平、电炉或电磁炉、电炉或电磁炉、试管塞、漏斗、滤纸、试试管塞、漏斗、滤纸、试管架、药匙、瓷缸、称量纸、橡皮筋、报管架、药匙、瓷缸、称量纸、橡皮筋、报纸等试剂：牛肉膏试剂：牛肉膏、蛋白胨、蛋白胨、氯化钠、氯化钠、琼脂琼脂粉、粉、蒸馏水、蒸馏水、0.1mol/L 的氢氧化钠溶液、的氢氧化钠溶液、0.1mol/L的盐酸溶液等的盐酸溶液等五五、方法和步骤、方法和步骤培养基的配方培养基的配方1.普通肉汤培养基，琼脂培养基的制备普通肉汤培养基，琼脂培养基的制备 100ml肉汤肉汤 牛肉膏粉牛肉膏粉 0.5克克 蛋白胨蛋白胨 1克克 氯化钠氯化钠 0.5克克普通琼脂：普通琼脂：1.取取50ml肉汤分装试管肉汤分装试管10支支4-5ml 2.取取50ml肉汤肉汤+1.51.8克（琼脂粉克（琼脂粉2-3%）用电磁炉加热熔化琼脂（需要完全融化）用电磁炉加热熔化琼脂（需要完全融化）10支支4-5ml 制备方法与步骤：制备方法与步骤：1.准确称量准确称量 2.混合加热溶解调混合加热溶解调pH值至值至7.6 3.加热煮沸维持加热煮沸维持5分钟（注意补充体积）分钟（注意补充体积）4.过滤过滤 5.分装：分装：4-5mL/管管 5.灭菌灭菌15p 15-20min(103.41kpa 15磅压力）磅压力）6.营养琼脂趁热摆斜面，完全凝固后，放置营养琼脂趁热摆斜面，完全凝固后，放置37培养箱进行无菌检查，培养箱进行无菌检查，18-24小时后放小时后放4 冰箱备用。
冰箱备用制备过程中的注意事项制备过程中的注意事项 1.初配好的牛肉膏蛋白胨溶液时偏酸性的，初配好的牛肉膏蛋白胨溶液时偏酸性的，故需要故需要NaOH调整，为避免过碱，应缓慢加调整，为避免过碱，应缓慢加入入NaOH，边加边搅拌，并不时地用，边加边搅拌，并不时地用pH试试纸测试2.将过滤好的肉汤分装试管，每管约将过滤好的肉汤分装试管，每管约5mL，塞上棉塞，用纸包装好扎好待灭菌塞上棉塞，用纸包装好扎好待灭菌3.将培养基置于高压蒸汽锅内，将培养基置于高压蒸汽锅内，121度灭菌度灭菌15-30分钟。